湖北地区鸡毒霉形体的分离鉴定及分子流行病学研究

论文摘要

鸡毒霉形体（Mycoplasma gallisepticum）在鸡群中可引起严重的慢性呼吸道病（Chronic respiratory disease, CRD）。该病在国内鸡群中非常普遍,可导致蛋鸡产蛋率下降,肉鸡出栏期延长。一旦和新城疫病毒、传染性支气管炎病毒、大肠杆菌等病原发生协同感染,则可引起较高的发病率和死亡率。目前,我国针对鸡毒霉形体的鉴定主要是采用病原分离培养及血清学鉴定等方法,但由于这些传统方法既费时又费力,因此无法满足临床快速诊断的要求。而且,针对湖北地区家禽养殖场（户）的鸡毒霉形体流行现状、耐药性和病原性的相关研究尚无系统报道。鉴于此,本课题拟选用16S-23S rRNA基因间隔序列Intergenic spacer regions, ISR)对湖北地区鸡毒霉形体流行毒株进行研究,该段序列兼有保守性和突变性的特点,既可满足对鸡毒霉形体临床感染的快速诊断,也可用于对其分子流行病学和病原学进行系统分析。本研究应用传统实验室分离培养和鉴定技术,结合限制性酶切长度多态性分析技术,对湖北地区流行的M. gallisepticum野毒株进行了分离鉴定和耐药性分析,建立了针对M. gallisepticum 16S-23S rRNA ISR PCR快速检测技术,并进行了分子流行病学调查和病原性研究。具体研究成果如下。1、鸡毒霉形体的分离鉴定及分离菌株的耐药性分析在湖北地区47个养殖场（户）共采集病样172份,经分离培养获得77株疑似霉形体分离物,进一步采用生化试验和代谢抑制试验进行鉴定,其中57株代谢抑制价在1：80以上,并采用16S rRNA PCR技术进一步检测,均扩增出186bp大小的特异性条带,鉴定为鸡毒霉形体,阳性检出率为33.1%,；另20株为非鸡毒霉形体,有待进一步鉴定。从各养殖场分离的鸡毒霉形体分离株中选取部分菌株进行药物敏感性试验,结果表明大部分临床分离株对泰妙菌素、吉它霉素和泰乐菌素高度敏感,而且分离自不同地区的分离株对抗菌药物的敏感性存在一定差异。2、鸡毒霉形体16S-23S rRNA ISR PCR诊断方法的建立及分子流行病学研究以鸡毒霉形体16S-23S rRNA基因间隔区为目的基因,建立PCR检测方法,对所有172份样品进行扩增分析,结果从70份病料中扩增出了850bp大小的特异性条带,其中包括57株经传统技术鉴定为阳性的病样,其阳性检出率为40.7%。同时采用该PCR方法及对上述分离获得的20株非鸡毒霉形体分离物进行分析,初步鉴定为家禽霉形体。因此,针对16S-23S rRNA基因间隔区建立的鸡毒霉形体PCR检测方法比传统技术具更高的敏感性。随后,将RFLP技术和PCR技术结合起来,采用限制性内切酶RsaⅠ对PCR扩增片段进行限制性片段长度多态性分析,根据酶切图谱可将所有分离菌株分为两个谱系（R1和R2）。同时,结合流行病学调查, R2基因型比R1基因型的菌株更为流行,且未见同一个场内同时发生两种基因型菌株感染的情况。进一步对分离株16S-23S rRNA基因间隔区进行序列比对和进化分析,来自各不同养殖场的分离菌株可归为三个亚群,有的菌株与参考株S6株为同一亚群,有的与F株为同一亚群,而参考株R株则独自成一个亚群。3、湖北地区鸡毒霉形体分离株致病性研究根据上述进化分析结果,选择在进化树上分别与S6和F株亲缘关系较近的XA41株和ML21株作为研究对象,以S6和F株作为参考菌株,分别对4周龄雏鸡进行攻毒实验,8天后以新城疫弱毒苗（Ⅳ系）进行激发感染。结果接种S6和XA41株的实验动物全部发病,有明显的呼吸道症状；通过剖检肉眼观察、组织学病理切片和电镜观察,发病动物主要以上呼吸道病理变化为主；经血清学检测,抗体阳性反应；S6和XA41株引起的气囊损伤程度分别为3和2.8；S6和XA41株对鸡胚致死率均为80%。而攻F株和ML21株的实验动物未出现明显临床症状；通过剖检肉眼观察、病理切片和电镜观察,各部位均无明显病变；气囊损伤程度均为0；抗体检测为阴性；F株和ML21株对鸡胚的致死率均为40%。表明XA41株和S6致病性相似,为强毒株；ML21株和F株相似,为弱毒株。因此,通过致病性研究结果初步确定16S-23S rRNA ISR可作为区分不同基因型鸡毒霉形体菌株致病性的分子工具。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 缩略词表
• 前言
• 1.1 霉形体的研究史
• 1.2 病原学特性
• 1.2.1 形态学研究
• 1.2.2 繁殖方式及其运动性
• 1.2.3 细胞结构
• 1.2.4 营养特征
• 1.2.5 有关霉形体微生态学方面研究
• 1.2.6 抗原特性
• 1.3. 有关鸡毒霉形体及鸡慢性呼吸道病的研究现状
• 1.3.1 有关鸡毒霉形体的研究历史
• 1.3.2 鸡毒霉形体的特殊形态及培养条件
• 1.3.3 鸡毒霉形体的生化特性及抵抗力
• 1.3.4 鸡毒霉形体的致病力
• 1.3.5 鸡毒霉形体相关基因的研究
• 1.3.6 鸡慢性呼吸道病的发病特征
• 1.3.7 鸡慢性呼吸道病的临床症状及病理变化
• 1.3.8 致病机理
• 1.3.9 免疫学研究现状
• 1.3.10 流行病学
• 1.3.11 诊断方法的研究
• 1.3.12 鸡慢性呼吸道病的防控与净化
• 1.4 本课题研究目的及意义
• 2 材料与方法
• 2.1 实验材料
• 2.1.1 实验主要器材
• 2.1.2 相关菌株及标准抗原和血清
• 2.1.3 实验动物及患病动物
• 2.1.4 鸡毒霉形体培养基
• 2.1.5 药物敏感性试验所用抗生素
• 2.1.6 常规鉴定方法所需其他试剂的配制
• 2.1.7 相关分子生物学试验所需试剂
• 2.1.8 分子生物学所用试剂的配制
• 2.1.9 制备病理切片所需的相关试剂
• 2.2 方法
• 2.2.1 兔抗鸡毒霉形体S6株血清的制备
• 2.2.2 样品的前期处理和霉形体的分离、培养
• 2.2.3 纯化
• 2.2.4 细菌的L型鉴定
• 2.2.5 鸡红细胞吸附试验
• 2.2.6 糖发酵试验
• 2.2.7 精氨酸水解试验
• 2.2.8 生长测定
• 2.2.9 鸡毒霉形体传统技术的鉴定
• 2.2.10 鸡毒霉形体16S RNA PCR鉴定
• 2.2.11 鸡毒霉形体耐药性分析
• 2.2.12 鸡毒霉形体16S-23S rRNA基因间隔区PCR检测方法的建立
• 2.2.13 16S-23S rRNA基因间隔区PCR检测方法特性的鉴定
• 2.2.14 16S-23S rRNA基因间隔区PCR检测方法的临床应用
• 2.2.15 16S-23S rRNAPCR方法与常规技术两者检测结果的对比
• 2.2.16 16S-23S rRNA基因间隔区的限制性内切酶图谱分析
• 2.2.17 鸡毒霉形体分离株16S-23S rRNA间隔区基因的克隆
• 2.2.18 16S-23S rRNA间隔区基因的序列测定
• 2.2.19 16S-23S rRNA间隔区基因的序列分析和进化分析
• 2.2.20 部分分离株和参考株致病性的研究
• 2.2.21 菌株毒力的评估
• 3. 结果与分析
• 3.1 霉形体的分离结果
• 3.2 霉形体的形态观察结果
• 3.3 霉形体培养特性及生化试验结果
• 3.4 霉形体的常规鉴定技术结果
• 3.4.1 霉形体的玻片凝集试验
• 3.4.2 代谢抑制试验
• 3.5 疑似鸡毒霉形体的16S RNA PCR鉴定结果
• 3.6 部分分离株和参考株的药物敏感性试验结果
• 3.7 16S-23S RRNA基因间隔区PCR方法特性的鉴定
• 3.7.1 特异性试验
• 3.7.2 敏感性试验
• 3.8 16S-23S基因间隔区PCR技术的临床检测结果
• 3.9 传统实验室分离鉴定方法与PCR方法的比较
• 3.10 湖北地区鸡毒霉形体感染分布情况
• 3.11 16S-23S RRNA基因间隔区RFLP酶切分析
• 3.12 16S-23S RRNA基因间隔区序列分析
• 3.13 16S-23S RRNA基因间隔区进化分析
• 3.14 攻毒实验菌株的选择
• 3.15 攻毒后相关菌株的主要生物学特性鉴定
• 3.16 实验动物临床表征和病理变化
• 3.16.1 发病情况及临床症状
• 3.16.2 电镜观察结果
• 3.16.3 病理剖检变化
• 3.16.4 病理组织切片
• 3.17 攻毒组抗体检测结果
• 3.18 攻毒组气囊病变等级评定
• 3.19 各毒株对SPF鸡胚的毒力测定结果
• 3.20 部分分离株致病性评估
• 4. 讨论
• 4.1 霉形体的分离
• 4.2 分离株的鉴定
• 4.3 参考株及部分分离株的药物敏感性实验
• 4.4 16S-23S RRNA基因间隔区PCR方法
• 4.4.1 该PCR检测方法的优势
• 4.4.2 鸡毒霉形体感染情况
• 4.4.3 鸡毒霉形体和其它病原微生物混合感染情况
• 4.5 扩增产物的RFLP分析
• 4.6 16S-23S RRNA基因间隔区序列分析
• 4.7 16S-23S RRNA基因间隔区进化分析
• 4.8 湖北地区鸡毒霉形体分子流行病学调查
• 4.9 病原性和16S-23S RRNAISR之间的关联性
• 4.10 新城疫弱毒苗的应用
• 4.11 实验中各菌株的致病性
• 5. 结论
• 参考文献
• 附录
• 致谢