芦笋多糖提取分离、纯化、初步结构鉴定及其抗氧化活性研究

论文摘要

芦笋中主要的天然活性成分有黄酮类化合物、多糖、皂苷。未来芦笋深加工的发展方向就是要从综合利用方面着手,比如说从芦笋采收或者加工后的一些废弃物中提取活性功能成分,这样既可以减少其对环境的污染,也能够增加其附加值,达到变废为宝的目的。本论文主要研究了芦笋中多糖的提取及纯化工艺,并对多糖进行分级,并对其结构鉴定做了初步的探讨,同时测定了它们的抗氧化活性,为芦笋产品的进一步开发提供一定理论依据。通过上述实验,得到了以下的结论：1.测定了芦笋中脂肪、蛋白质、多糖、一些人体必须的矿质元素的含量,并且做了简单的分析。为芦笋作为保健食品的开发利用提供了一些理论依据,丰富了食品化学研究内容,对充分利用我国天然植物资源有着重大的科学意义。2.以绿芦笋及其下脚料为原料,经自然风干,过40目筛子处理后得到芦笋干粉。并对热水浸提法提取芦笋中多糖的工艺进行了探讨。在单因素试验基础上,以提取温度、提取时间、料液比、提取次数为响应因素,芦笋多糖提取率为响应值,根据中心组合及Box-Behnken试验设计原理采用四因素三水平的响应面分析法,确定最佳提取工艺。结果表明,热水浸提法的最佳工艺条件为提取温度81℃、提取时间2h、料液比1：25、提取次数3次。模型为Y=-77.324+1.575A+14.545B+5.983×10-2C+6.922D-9.710×10-3A2-3.604B2-1.201D2。最佳提取工艺条件下多糖提取率为12.67%,与预测值接近。方差分析结果表明提取过程中对芦笋多糖提取率影响程度由强到弱的因素为提取次数>料液比>提取温度>提取时间。3.对芦笋粗多糖进行分离纯化,分别采用了Sevag法、盐酸法、三氯乙酸法、胰蛋白酶法去蛋白,比较四种方法之后,得到胰蛋白酶法的去蛋白效果最好。然后在单因素的基础上,以酶用量、酶解温度、酶解时间为响应因素,以多糖保留率和蛋白脱除率为响应值,对胰蛋白酶法去蛋白方法进行优化。结果表明,以多糖保留率为主要指标的模型为Y1=4.912+13.767A-0.489B+2.654 C-1.446A2-0.0303C2；以蛋白脱除率为主要指标的模型为Y2=-48.046+16.020A+3.864B+0.601C-1.568A2-0.0568B2。综合多糖保留率和蛋白脱除率考虑,胰蛋白酶法去蛋白的最佳工艺：酶用量5%、酶解温度36℃,酶解时间48min。经过验证实验后得到的多糖保留率和蛋白脱除率分别为87.94%、87.75%。脱蛋白后的多糖经过DEAE-SephadexA-25纤维素分离纯化后得到A1和A2,后分别经Sephadex G-200凝胶柱进一步进行纯化得到多糖APS-1和APS-2,凝胶过滤法测定其分子量分别为8.47x104、13.8×104。4.对多糖进行基本结构的鉴定和体外抗氧化实验,对多糖两个级分APS-1、APS-2进行红外光谱分析结果表明,其具有典型的多糖特征峰；气相色谱分析表明,APS-1、APS-2主要由鼠李糖、阿拉伯糖、木糖、葡萄糖、半乳糖五种单糖组成,其相对含量分别为12.76%,20.65%,7.03%,19.81%,39.75%和15.26%,18.85%,5.84%,14.62%,45.43%；紫外分析表明,APS-2在260-280nm处有弱吸收,表明该多糖中可能含有少量的蛋白质或是一种蛋白结合糖。而体外抗氧化活性研究表明,芦笋多糖对羟自由基、超氧阴离子自由基都有一定的清除作用,同时还具有一定的剂量效应,通过比较IC50得到Vc对羟基自由基、超氧阴离子自由基、DPPH自由基的清除能力是芦笋多糖的倍数分别为27.1、27.4、169.1。

论文目录

• 摘要
• ABSTRACT
• 第一章 文献综述
• 1 多糖的提取、分离与纯化
• 1.1 多糖的提取方法
• 1.1.1 溶剂提取法
• 1.1.2 酸碱提取法
• 1.1.3 生物酶提取法
• 1.2 多糖分离
• 1.3 多糖纯化
• 1.3.1 除去小分子
• 1.3.2 去蛋白常用方法
• 1.3.3 色素的去除
• 1.3.4 分级纯化
• 2 多糖的结构研究
• 2.1 化学方法
• 2.2 仪器法
• 2.2.1 高效液相色谱法（HPLC）
• 2.2.2 气相色谱法（GC）
• 2.2.3 红外光谱法（IR）
• 2.2.4 质谱法（MS）
• 2.2.5 电泳技术（CE）
• 3 多糖的生物活性
• 3.1 降血脂作用
• 3.2 免疫调节作用
• 3.3 抗肿瘤作用
• 3.4 抗病毒作用
• 3.5 抗衰老作用
• 3.6 抗辐射
• 4 课题的研究内容及创新之处
• 第二章 芦笋中各物质含量测定及芦笋多糖提取工艺优化
• 第一节 芦笋中各物质含量的测定
• 1 材料与方法
• 1.1 材料与试剂
• 1.2 仪器与设备
• 1.3 实验方法
• 1.3.1 芦笋粗脂肪含量的测定
• 1.3.2 芦笋中蛋白质含量的测定
• 1.3.3 芦笋中多糖含量测定
• 1.3.4 芦笋中部分微量元素的测定
• 2 结果与分析
• 2.1 芦笋中脂肪含量
• 2.2 芦笋中蛋白质含量
• 2.3 芦笋中多糖含量
• 2.4 芦笋中部分微量元素含量
• 第二节 芦笋多糖分离提取工艺优化
• 1 实验材料
• 2 实验方法
• 2.1 芦笋干粉的制备
• 2.2 芦笋粗多糖的热水浸提工艺
• 2.3 芦笋多糖旋转正交实验设计
• 3 结果与分析
• 3.1 提取单因素试验结果与分析
• 3.1.1 提取温度对多糖提取率的影响
• 3.1.2 提取时间对多糖提取率的影响
• 3.1.3 液料比对多糖提取率的影响
• 3.1.4 提取次数对多糖提取率的影响
• 3.2 回归模型的建立与显著性检验
• 3.3 响应面及等高线分析
• 3.4 回归模型的试验验证
• 4 结论
• 第三章 旋转正交法优化芦笋多糖提纯工艺
• 1 材料与方法
• 1.1 实验材料
• 1.2 实验仪器和药品
• 1.2.1 药品
• 1.2.2 实验仪器
• 1.3 实验方法
• 1.3.1 芦笋多糖的提取
• 1.3.2 苯酚硫酸法测定多糖含量
• 1.3.3 蛋白质含量的测定
• 1.3.4 脱蛋白的方法
• 2 结果与分析
• 2.1 Sevag法脱蛋白效果
• 2.2 盐酸法的脱蛋白效果
• 2.3 三氯乙酸法脱蛋白效果
• 2.4 酶法脱蛋白效果
• 2.4.1 单因素实验结果与分析
• 2.4.2 回归模型的建立与显著性检验
• 2.4.3 响应面及等高线分析
• 2.4.4 回归模型的试验验证
• 2.5 四种脱蛋白方法的比较
• 3 结论
• 第四章 芦笋多糖结构初步鉴定
• 1 材料与方法
• 1.1 实验材料
• 1.2 主要试剂
• 1.3 主要仪器
• 1.4 实验方法
• 1.4.1 芦笋多糖的脱色
• 1.4.2 芦笋多糖柱层析柱制备
• 1.4.3 芦笋多糖的纯度鉴定
• 1.5 芦笋多糖的组成分析
• 1.5.1 芦笋多糖水解
• 1.5.2 单糖糖腈乙酸酯衍生物的制备
• 1.5.3 标准单糖气相色谱分析
• 1.5.4 气相色谱的工作参数
• 1.6 芦笋多糖的结构分析
• 1.6.1 多糖分子量的测定
• 1.6.2 红外光谱分析
• 1.6.3 紫外光谱分析
• 2 结果与分析
• 2.1 芦笋多糖级分制备
• 2.2 各个多糖级分的性状
• 2.3 芦笋多糖各级分的纯度鉴定
• 2.4 多糖中单糖组分分析
• 2.5 多糖分子量测定结果
• 2.6 多糖红外图谱分析
• 2.7 多糖紫外图谱分析
• 3 结论
• 第五章 多糖抗氧化活性的研究
• 1 材料与方法
• 1.1 实验材料
• 1.2 主要试剂
• 1.3 主要仪器
• 1.4 实验方法
• 1.4.1 芦笋多糖的制备
• 1.4.2 芦笋多糖对羟基自由基的清除效果
• 1.4.3 芦笋多糖对超氧阴离子的清除效果
• 1.4.4 芦笋多糖对DHPP自由基清除效果
• 2 结果与分析
• 2.1 芦笋多糖与Vc对羟基自由基的清除效果的比较
• 2.2 芦笋多糖与Vc对超氧阴离子的清除效果的比较
• 2.3 芦笋多糖与Vc对DHPP自由基清除效果的比较
• 3 结论
• 第六章结论
• 1 本论文主要结论
• 2 展望
• 参考文献
• 致谢
• 附录1 攻读硕士期间发表的论文