苦苣苔科植物牛耳朵化学成分及其活性研究

论文摘要

牛耳朵（Chirita eburnea Hance）是苦苣苔科（Gesneriaceae）唇柱苣苔属（Chirita）植物牛耳朵的全草,别名为石三七、石虎耳等,为广西民间常用药材,主产广西、广东、湖南、湖北、四川及贵州等地。牛耳朵根茎或全草入药,性味甘、平,有清肺、止血、止咳、除湿、解毒、治肺结核等功用,广西民间广泛用来治疗肺结核、高血压等疾病。但由于缺乏系统的理论基础研究,现阶段对牛耳朵的利用仅限于民间草药,其药用价值没能很好开发。本课题拟选择广西民间草药牛耳朵为研究对象,对其进行系统的化学成分研究,并研究部分单体成分的体外抗肿瘤活性。为进一步开发利用该草药资源奠定药用化学物质基础,也为牛耳朵药材及其提取物质量控制提供科学依据。具体研究内容和取得的成果如下。1.牛耳朵中脂溶性非极性成分研究首次采用气相色谱-质谱联用技术对牛耳朵脂溶性非极性易挥发成分进行分析,结合质谱离子图及NIST05a.L化合物谱库检索对分离出的组分进行鉴定,并应用面积归一化法测定各组分的相对百分含量,共分离出30个组分,鉴定其中24个组分,占总量的87.38%。牛耳朵脂溶性主要成分为:亚油酸乙酯（10.86%）,油酸乙酯（9.46%）,十四烷酸乙酯（9.15%）,β-谷甾醇（6.99%）,n-棕榈酸（4.89%）。2.牛耳朵极性化学成分的研究对牛耳朵极性化学成分进行系统研究。利用溶剂萃取、柱层析分离和液相制备等方法从牛耳朵全草极性部位中分离得到11个化合物,并经质谱（MS）、核磁共振谱（1H-NMR、13C-NMR）等光谱技术及化学方法鉴定了其中9个化合物。分别为:β-谷甾醇（CE-1）、1-羟基-2-甲氧基-7-甲基蒽醌（Peganone 2）（CE-2）、1, 7-二羟基-6-甲氧基-2-甲基蒽醌（Robustaquinone D）（CE-5）、5, 7, 4′-三羟基黄酮（芹菜素,Apigenin）（CE-6）、3, 4-二羟基苯乙醇-3-O-咖啡酰基-β-D-葡萄糖苷（PlantainosideΑ）（CE-7）、3, 4-二羟基苯乙醇-6-O-葡萄糖咖啡酰基-β-D-葡萄糖苷（Chiritoside C）（CE-8）、3, 4-二羟基苯乙醇-2-O-咖啡酰基-β-D-葡萄糖苷（Plantaninoside B）（CE-9）、3, 4-二羟基苯乙醇-β-D-葡萄糖（1→3）-4-O-咖啡酰基-β-D-葡萄糖苷（Plantamajoside）（CE-10）、3, 4-二羟基苯乙醇-4-O-咖啡酰基-β-D-葡萄糖苷（Desrhamnosylverbascoside）（CE-11）。化合物类型涉及有苯乙醇苷类、蒽醌类、甾醇类。其中化合物CE-7、CE-8、CE-9、CE-10、CE-11为苯乙醇苷类成分;CE-2、CE-5为蒽醌类成分;CE-6为黄酮;CE-1为甾醇。化合物CE-5、CE-10首次从该科植物中分离得到,化合物CE-1、CE-2、CE-6、CE-7、CE-8、CE-9、CE-11均为首次从该植物中分离得到。3.苯乙醇苷类单体化合物的高效液相色谱制备方法研究采用MCI柱层析预处理和半制备型反相高效液相色谱法从牛耳朵中分离制备得到了5种苯乙醇苷类单体。高效液相制备条件为:Eclipse XDB-C18 （9.4×250 mm,5μm）半制备柱;流动相为甲醇-水,流速为4 ml/min,采用梯度洗脱方式,制备得到5个组分。经波谱（EI-MS、1H-NMR、13C-NMR）分析,分别鉴定为PlantainosideΑ（CE-7）、Chiritoside C（CE-8）、Plantaninoside B（CE-9）、Plantamajoside（CE-10）和Desrhamnosylverbascoside（CE-11）。高效液相色谱分析表明所制备的5种化合物的纯度均高于98%。该方法分离条件简单,高效,一次可得到5个单体,目标产物纯度较高。4.建立能同时检测牛耳朵中4种苯乙醇苷类的含量测定方法。以50%甲醇为溶剂,采用超声提取法制备样品。采用ZORBAX SB-C18（250 mm×4.6 mm,5μm）色谱柱;流动相为乙睛和水（含0.05%冰醋酸）,梯度洗脱;流速1 ml/min;检测波长为330 nm;柱温30℃。结果表明:4种苯乙醇苷类化合物Plantainoside A、Chiritoside C、Plantaninoside B和Desrhamnosylverbascoside在1.08μg、0.43.2μg、0.43.2μg、0.43.2μg之间线性关系良好,样品在72 h内稳定,精密度、重现性均符合检测要求,且样品处理简单,分析检测时间短,可适用于牛耳朵原料及其提取物的质量控制。5.单体化合物的细胞毒活性研究对分离得到的8个单体化合物CE-2、CE-4、CE-5、CE-6、CE-7、CE-8、CE-9、CE-10、CE-11进行体外抗肿瘤活性（细胞毒性）的测试。实验结果发现,化合物CE-4对人肺大细胞癌细胞株NCI-H460有较强的细胞毒性,半数抑制浓度IC50为34.2μg/ml;化合物CE-5对人肺癌细胞株SPC-A1有中等强度的细胞毒性,半数抑制浓度IC50为50.1μg/ml;CE-9,CE-10对人肺癌细胞株SPC-A1有一定的细胞毒性,半数抑制浓度IC50分别为88.2μg/ml和97.3μg/ml;而CE-2、CE-7、CE-8、CE-11对4种肿瘤细胞株都没有抑制作用。预示化合物CE-4、CE-5、CE-9和CE-10有一定的体外抗肿瘤活性。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 缩略词表
• 前言
• 第1章 苦苣苔科植物植物研究概况
• 1.1 苦苣苔科植物的新种
• 1.2 苦苣苔植物化学成分的研究进展
• 1.2.1 黄酮类
• 1.2.2 苯乙醇苷类
• 1.2.3 萜类和甾体类
• 1.2.4 醌类
• 1.2.5 其他类
• 1.3 苦苣苔科植物的药理研究和应用
• 1.3.1 药理研究
• 1.3.2 临床应用
• 1.3.3 园林利用
• 1.3.4 医药开发
• 1.4 本研究的目的意义和主要内容
• 1.4.1 目的意义
• 1.4.2 主要内容
• 第2章 牛耳朵脂溶性成分的GC-MS 分析
• 2.1 材料、仪器和试剂
• 2.1.1 材料
• 2.1.2 仪器
• 2.1.3 试剂
• 2.2 方法
• 2.2.1 牛耳朵脂溶性成分的提取
• 2.2.2 GC-MS 条件
• 2.3 结果与讨论
• 2.3.1 牛耳朵脂溶性成分分析
• 2.3.2 讨论
• 第3章 牛耳朵化学成分的研究
• 3.1 实验部分
• 3.1.1 实验仪器
• 3.1.2 试剂与材料
• 3.1.3 提取与分离
• 3.2 结构解析
• 3.2.1 苯乙醇苷类化合物
• 3.2.2 黄酮类化合物
• 3.2.3 甾醇类物质
• 3.2.4 蒽醌类物质
• 3.3 化合物的理化性质与光谱数据
• 第4章 半制备高效液相色谱法制备5 种苯乙醇苷类单体
• 4.1 仪器与材料
• 4.1.1 仪器
• 4.1.2 试剂与材料
• 4.2 实验方法
• 4.2.1 牛耳朵中苯乙醇苷类化合物的提取分离
• 4.2.2 色谱条件
• 4.3 结果与讨论
• 4.3.1 HPLC 法对制备的样品进行纯度测定
• 4.3.2 结构鉴定
• 4.3.3 半制备色谱条件的建立
• 4.4 结论
• 第5章 高效液相色谱法测定牛耳朵中4 种主要苯乙醇苷的含量
• 5.1 仪器、试剂与材料
• 5.1.1 仪器
• 5.1.2 试剂与材料
• 5.2 方法与结果
• 5.2.1 色谱条件
• 5.2.2 对照品溶液的制备
• 5.2.3 供试品溶液的制备
• 5.2.4 线性关系考察
• 5.2.5 精密度实验
• 5.2.6 稳定性实验
• 5.2.7 重复性实验
• 5.2.8 加样回收率实验
• 5.2.9 样品的测定
• 5.3 讨论
• 5.3.1 提取溶剂的选择
• 5.3.2 提取方法的选择
• 5.3.3 检测波长的选择
• 5.3.4 流动相的选择
• 5.4 结论
• 第6章 单体化合物的细胞毒活性研究
• 6.1 实验材料
• 6.2 实验方法
• 6.2.1 RPMI-1640 培养液的配制
• 6.2.2 细胞培养及传代
• 6.2.3 分组
• 6.2.4 实验步骤
• 6.2.5 评价指标
• 6.2.6 实验结果
• 第7章 总结
• 参考文献
• 附录
• 研究生期间已经发表的文章
• 致谢