cDNA-AFLP技术分离桂花香气相关基因

论文摘要

桂花（Osmanthus Fragrans）是木犀科木犀属的代表种,是优良的园林绿化树种和香花树种。本研究以桂花的花蕾为材料,运用cDNA-AFLP技术,分离桂花花香形成过程中差异片段,通过克隆测序, BLAST分析,获得的6个可能与香味相关的基因片段,为下一步揭示桂花香味物质代谢途径奠定基础,希望为花卉香味的遗传改良提供一条新途径,主要试验结果如下:1建立适合桂花花蕾总RNA的提取技术体系采用改良热硼酸法,改良Tris-硼酸法,试剂盒提取桂花花蕾总RNA,比较结果显示试剂盒法提取的总RNA,条带完整,质量好,纯度高,适合开展试验。2利用cDNA-AFLP技术分离桂花花香形成过程中差异基因采用末端两个选择性碱基的16条EcoR I引物和16条Mse I进行选择性扩增,共256对引物组,通过筛选,确定160对引物组进行扩增。试验共回收差异条带100带,获得50条测序结果。在NCBI数据库中进行BLAST比对,发现有31条序列在nr库中搜索到相似性较高的基因。另外17条序列没有搜索到同源序列,推测为未知基因。分析显示31个TDFs中6个TDFs可能与植物香气成分相关,分别命名为2OGox2,C4H1,CCD4,AACT ,CFAT,LOX。3采用RT-PCR技术分离CFAT和LOX的3′端序列选取其中两个可能与桂花香气相关基因片段CFAT和LOX,设计引物,采用RT-PCR技术扩增其3′端序列,分别进行克隆、测序和拼接,获得了CFAT 3′末端,共862bp,LOX 3′末端,共1588bp。本研究将为进一步研究桂花花香相关物质的代谢途径,以及为花卉香味的遗传改良奠定基础。

论文目录

• 缩写词
• 摘要
• ABSTRACT
• 第一章 前言
• 1 研究背景
• 2 文献综述
• 2.1 桂花香味物质研究进展
• 2.2 花卉香味物质的种类及合成途径
• 2.2.1 萜类物质代谢途径
• 2.2.2 苯丙烷类代谢途径
• 2.2.3 脂肪酸衍生物代谢途径
• 2.3 花卉香味物质合成途径中几个重要酶的研究进展
• 2.3.1 类胡萝卜素裂解双加氧酶研究进展
• 2.3.2 肉桂酸-4-羟化酶研究进展
• 2.3.3 脂肪氧化酶的研究进展
• 2.4 花卉香味基因工程研究进展
• 2.4.1 国外香味基因工程研究进展
• 2.4.2 国内研究进展
• 3 差异表达基因的分离方法
• 3.1 mRNA 差异显示技术
• 3.2 抑制消减杂交
• 3.3 cDNA 代表性差异分析
• 3.4 基因表达系列分析法
• 3.5 cDNA 微列阵
• 3.6 cDNA-AFLP 技术研究进展
• 3.6.1 cDNA-AFLP 技术的基本原理和实验流程
• 3.6.2 cDNA-AFLP 技术的优点
• 3.6.3 cDNA-AFLP 技术的应用
• 4 研究的目的及意义
• 5 本研究的技术路线
• 第二章 桂花花蕾总 RNA 提取和 cDNA –AFLP 体系的建立
• 1 试验材料
• 1.1 材料
• 1.2 主要仪器与试验试剂
• 2 试验方法
• 2.1 桂花总RNA 的提取及检测
• 2.1.1 改良热硼酸盐法提取组织总RNA
• 2.1.2 改良的Tris-硼酸法
• 2.1.3 百泰克植物多糖多酚提取试剂盒
• 2.2 RNA 质量检测
• 2.2.1 电泳检测
• 2.2.2 紫外分光光度测定
• 2.3 cDNA-AFLP 分析
• 2.3.1 双链cDNA 的合成及纯化
• 2.3.2 cDNA-AFLP 分析
• 2.4 聚丙烯酰胺凝胶电泳
• 2.4.1 制胶
• 2.4.2 电泳
• 2.4.3 银染
• 3 结果与分析
• 3.1 桂花花瓣总RNA 的提取
• 3.2 预扩增结果
• 3.3 选择性扩增产物聚丙烯酰胺凝胶电泳结果分析
• 3.4 cDNA差异条带的选择
• 4 讨论
• 4.1 桂花花瓣总RNA 的提取
• 4.2 cDNA-AFLP 试验体系
• 4.2.1 cDNA-AFLP 技术的优点
• 4.2.2 cDNA-AFLP 技术的注意事项
• 第三章 差异片段的分离与分析
• 1 试验试剂
• 2 试验方法
• 2.1 差异片段的回收
• 2.2 差异片段的二次扩增
• 2.3 差异片段纯化
• 2.4 目的片段与 pMD18-T -vector 的连接
• 2法'>2.5 大肠杆菌 DH5α 感受态细胞的制备——CaCl₂法
• 2.6 连接产物的转化
• 2.7 重组质粒的PCR 检测
• 2.8 序列测定及分析
• 3 结果与分析
• 3.1 差异片段的二次扩增
• 3.2 TDFs 的序列分析结果
• 4 讨论
• 4.1 萜类合成路径中的酶
• 4.2 苯丙烷类代谢途径中的酶
• 4.3 脂肪酸衍生物合成途径的主要调控酶
• 第四章 利用 RT-PCR 技术分离 CFAT, LOX cDNA 3′端序列
• 1 材料与方法
• 1.1 材料
• 1.2 方法
• 1.2.1 总RNA 的提取及cDNA 第一链的合成
• 1.2.2 引物设计
• 1.2.3 利用RT-PCR 技术扩增CFAT, LOX 片段3′序列
• 1.3 目的片段的回收纯化、克隆、测序
• 1.4 序列分析
• 2 结果与分析
• 2.1 总 RNA 的提取及 cDNA 第一链的合成
• 2.2 利RT-PCR 技术扩增CFAT、LOX 片段3′序列
• 2.3 PCR 产物序列分析
• 2.3.1 CFAT 3′PCR 产物序列分析
• 2.3.2 LOX 3′PCR 产物序列分析
• 3 讨论
• 第五章 小结
• 参考文献
• 致谢