植物雌激素大豆黄酮对鸡胚卵巢和成鸡卵泡发育调控机理的研究

论文摘要

本研究建立了鸡胚卵巢生殖细胞-体细胞共培养模型，研究了人参皂甙、促性腺激素和性激素对生殖细胞增殖的调控及其机理和异黄酮植物雌激素-大豆黄酮对鸡胚卵巢生殖细胞增殖的促进作用，并在细胞水平对其作用机理进行了深入探讨。同时，以伊莎鸡和丝羽乌骨鸡为研究对象，在体内从整体、分子等不同水平探讨了大豆黄酮对鸡产蛋性能的影响及其卵泡发育调节机制，其结果为大豆黄酮在蛋鸡生产上的应用及提高禽类特别是地方品种禽类的生产性能提供了科学的理论依据。1．鸡胚卵巢生殖细胞-体细胞共培养模型的建立及其验证和应用探索鸡胚卵巢生殖细胞分离培养的简易方法及条件，为深入研究内源性激素和异黄酮类植物雌激素对卵巢生殖细胞发育的影响及其机制提供实验模型。采用机械分散加胶原酶分解法分离18胚龄鸡胚卵巢细胞，体外共培养生殖细胞和体细胞，并用c-kit单克隆抗体进行生殖细胞的鉴定。结果表明添加10μg／mL胰岛素、5μg／mL转铁蛋白和3×10-8mol／L亚硒酸钠的培养液（称ITS培养液）能较好地维持生殖细胞的存活和增殖。此外，采用c-kit免疫细胞化学方法对生殖细胞进行了特异性鉴定，结果显示卵巢生殖细胞呈c-kit染色阳性，而体细胞呈c-kit染色阴性。同时利用该模型研究了人参皂甙（GS）对鸡胚卵巢生殖细胞增殖的影响及其信号转导机制。结果显示GS（0.1～10μg／mL）可明显提高生殖细胞的数目（P＜0.05），蛋白激酶C（PKC）激活剂Phorbol-12-myristate-13-acetate(PMA，10-8～10-6M)可增强这种促进作用，而PKC抑制剂H7(10-7～10-5M)则减弱了这种促进作用，并都呈现一定的剂量-效应关系。细胞增殖核抗原-标记指数（PCNA-LI）统计结果显示出与生殖细胞数目变化相似的趋势。以上结果表明GS能够促进鸡胚卵巢生殖细胞增殖，PKC信号途径可能参与了GS对卵巢生殖细胞的发育调节。同时实验进一步证实生殖细胞-体细胞共培养模型可以作为评价激素、激素样作用的外源性物质对卵巢生殖细胞体外增殖调节的实验模型。2．FSH对鸡胚卵巢生殖细胞增殖的影响及其信号转导机制的研究利用生殖细胞-体细胞共培养模型研究了FSH对鸡胚卵巢生殖细胞增殖的影响及其信号转导机制。18胚龄鸡胚卵巢细胞在培养的同时用FSH和腺苷酸环化酶（AC）的激活剂Forskolin（FRSK）、PKA抑制剂H89、PKC激活剂PMA、PKC抑制剂H7单独或联合处理。细胞培养48h后，计数生殖细胞数目并用PCNA标记增殖细胞，统计生殖细胞的PCNA-LI。结果显示FSH（10～1000ng／mL）可明显提高生殖细胞的数目（P＜0.05），FRSK(10-7～10-5M)和PMA(10-8～10-6M)可增强这种促进作用，而H89(10-7～10-5M)和H7(10-7～10-5M)则分别减弱了FSH的促进作用。并都呈现出剂量-效应关系。PCNA-LI统计结果显示出与生殖细胞数目变化相似的趋势。以上结果表明FSH能够促进鸡胚卵巢生殖细胞增殖，PKA和PKC信号途径可能都参与了FSH对卵巢生殖细胞发育的调节。3．雄激素对培养鸡胚卵巢生殖细胞增殖的影响及其作用机理的研究实验利用已建立的生殖细胞-体细胞共培养模型研究了雄激素对鸡胚卵巢生殖细胞增殖的影响及其作用机理。卵巢细胞培养同时用睾酮（testosterone，T）和雄激素受体阻断剂Flutamide（FLU）、雌激素受体阻断剂Tamoxifen（TAM）、芳香化酶抑制剂Letrozole（LET）单独或联合处理。细胞培养48h后，计数生殖细胞数目并用PCNA标记增殖细胞，统计生殖细胞PCNA-LI。结果发现T(10-8～10-6M)明显提高了生殖细胞的数目（P＜0.05），这种促进作用可被FLU（10～1000ng／mL）、TAM（10～1000ng／mL）、LET(10-9～10-7M)所阻断，并呈现一定的剂量-效应关系，PCNA-LI进一步证实了上述结论。以上结果表明，生殖细胞-体细胞共培养模型可以作为评价激素对卵巢生殖细胞体外增殖调节的实验模型。T可以通过雄激素样和雌激素样两种作用方式促进鸡胚卵巢生殖细胞的增殖。4．大豆黄酮对鸡胚卵巢生殖细胞增殖的影响及其作用机理的研究利用生殖细胞-体细胞共培养模型研究了植物雌激素大豆黄酮（DAI）对鸡胚卵巢生殖细胞增殖作用的雌激素样作用和抗氧化作用。卵巢细胞培养的同时用DAI和雌激素受体阻断剂TAM单独或联合处理。处理48h后，计数生殖细胞的数目并用PCNA标记增殖细胞，统计生殖细胞的PCNA-LI。结果发现DAI可显著提高生殖细胞的数目（P＜0.05），且这种促进作用可被TAM所阻断。同时，生殖细胞PCNA-LI与生殖细胞数目变化呈现相似的趋势。为了进一步研究DAI的抗氧化作用，卵巢细胞被暴露于次黄嘌呤／黄嘌呤氧化酶活性氧产生系统。通过测定超氧化物歧化酶活力及谷胱甘肽水平的变化对系统抗氧化性能进行了评价。处在活性氧产生系统中的卵巢细胞受到严重损伤，这种损伤可被DAI，DAI+TAM明显缓解（P＜0.05）。这些结果表明DAI可通过雌激素样作用促进卵巢生殖细胞增殖，同时可以通过抗氧化特性缓解活性氧引起的细胞毒性作用。5．大豆黄酮对伊莎鸡和丝羽乌骨鸡产蛋性能和卵泡发育相关基因表达的影响探讨了DAI对伊莎鸡和丝羽乌骨鸡产蛋性能及不同发育阶段卵泡中相关基因，包括促性腺激素受体（FSHR、LHR）、芳香化酶（P450arom）和催乳素受体（PRLR）mRNA表达的影响。分别随机选取16只产蛋后期伊莎鸡或丝羽乌骨鸡，等分为大豆黄酮组和对照组。对照组饲喂基础日粮，实验组在基础日粮中添加10mg／kg DAI，逐日记录产蛋个数、产蛋重，实验持续7周。实验结束后每组随机采集20枚蛋，分离蛋白和蛋黄，并称重；取出小黄卵泡和大白卵泡，分离排卵前卵泡（F1，F2，F3……）的颗粒层，通过相对定量RT-PCR法检测FSHR、LHR、P450arom和PRLR mRNA表达的相对丰度，同时比较DAI对丝羽乌骨鸡和伊莎鸡的影响强度。结果显示，FSHR、LHR、P450arom、PRLR在伊莎鸡／丝羽乌骨鸡不同发育阶段卵泡中的表达存在差异，DAI明显提高了产蛋晚期伊莎鸡／丝羽乌骨鸡的产蛋率及小黄卵泡、大白卵泡的数量，显著降低了丝羽乌骨鸡卵泡闭锁率，平均蛋重及排卵前卵泡数目也都存在增多趋势；部分卵泡FSHR、LHR、P450arom和PRLR四种基因mRNA表达的相对丰度显著增加，丝羽乌骨鸡对DAI表现出比伊莎鸡更高的敏感性。以上结果表明，在产蛋后期伊莎鸡／丝羽乌骨鸡基础日粮中添加DAI能够显著提高产蛋性能和不同发育阶段卵泡数目，降低卵泡闭锁率，并且上调部分卵泡中相关基因的表达以促进卵泡发育。综上所述，本研究建立了鸡胚卵巢生殖细胞-体细胞共培养模型，发现c-kit可以对生殖细胞进行特异性鉴定。通过人参皂甙、促性腺激素和性激素对生殖细胞增殖的调控及其机理研究，对该模型进行了有效评价。实验证实GS能够促进鸡胚卵巢生殖细胞增殖，PKC信号途径可能参与GS对卵巢生殖细胞的发育调节；FSH能够促进鸡胚卵巢生殖细胞增殖，PKA和PKC信号途径都可能参与了其对卵巢生殖细胞的发育调节；T可以通过雄激素样和雌激素样两种作用方式促进鸡胚卵巢生殖细胞的增殖。DAI可通过雌激素样作用显著促进卵巢生殖细胞的增殖，且可以通过抗氧化特性缓解活性氧引起的细胞毒性作用；同时，DAI明显提高了产蛋晚期伊莎鸡和丝羽乌骨鸡的产蛋性能及不同发育阶段卵泡数量，显著降低了丝羽乌骨鸡卵泡闭锁率；显著上调了部分卵泡FSHR、LHR、P450arom和PRLR四种基因mRNA的表达水平。这些结果为大豆黄酮在蛋鸡生产上的应用及提高禽类特别是地方品种禽类的生产性能提供了科学的理论依据。

论文目录

• 摘要
• ABSTRACT
• 缩略词表
• 引言
• 第一篇 文献综述
• 第一章 禽类性腺发育调控机制
• 1.性染色体和基因表达对禽类性腺发育的调控
• 2.类固醇激素对禽类性腺发育的调控
• 3.下丘脑-垂体-性腺轴对禽类性腺发育的调控
• 第二章 禽类卵泡发育调控机制
• 1.禽类生殖系统的发育
• 2.禽类卵泡的发育
• 3.结语
• 第三章 异黄酮植物雌激素在畜禽生产中的应用及作用机理
• 1.异黄酮植物雌激素的种类、性质、吸收与代谢
• 2.异黄酮植物雌激素在畜禽生产中的作用
• 3.异黄酮植物雌激素的作用机理
• 第二篇 实验研究
• 第一章 鸡胚卵巢生殖细胞-体细胞共培养模型的建立及其验证和应用
• 第一节 鸡胚卵巢生殖细胞-体细胞共培养模型的建立
• 1.引言
• 2.材料
• 3.方法
• 4.结果
• 5.讨论
• 6.小结
• 第二节 人参皂甙对培养的鸡胚卵巢生殖细胞增殖的影响
• 1.引言
• 2.材料
• 3.方法
• 4.结果
• 5.讨论
• 6.小结
• 第二章 促性腺激素和性激素对鸡胚卵巢生殖细胞增殖的影响
• 第一节 FSH对培养的鸡胚卵巢生殖细胞增殖的影响及其信号转导机制的研究
• 1.引言
• 2.材料
• 3.方法
• 4.结果
• 5.讨论
• 6.小结
• 第二节 雄激素对培养的鸡胚卵巢生殖细胞增殖的影响及其作用机理的研究
• 1.引言
• 2.材料
• 3.方法
• 4.结果
• 5.讨论
• 6.小结
• 第三章 植物雌激素大豆黄酮对培养的鸡胚卵巢生殖细胞增殖的影响及其作用机理的研究
• 1.引言
• 2.材料
• 3.方法
• 4.结果
• 5.讨论
• 6.小结
• 第四章 大豆黄酮对伊莎鸡产蛋性能和卵泡发育相关基因表达的影响
• 1.引言
• 2.材料
• 3.方法
• 4.结果
• 5.讨论
• 6.小结
• 第五章 大豆黄酮对丝羽乌骨鸡产蛋性能和卵泡发育相关基因表达的影响
• 1.引言
• 2.材料
• 3.方法
• 4.结果
• 5.讨论
• 6.小结
• 第六章 提示与创新点
• 参考文献
• 作者简介
• 致谢