Lymphopenia Setting对肿瘤疫苗免疫效果的影响及机制研究

论文摘要

肿瘤特异性免疫生物治疗已成为继手术、放化疗后重要的辅助治疗手段，实验性或临床前期的研究初步证实，对于非实体瘤、转移性肿瘤及晚期肿瘤，应用肿瘤疫苗进行主动免疫和／或被动转输免疫效应细胞，对抑制肿瘤生长、延长生存时间具有重要意义。但是，大多数肿瘤患者，特别是手术后放、化疗的患者，却通常不开展此类治疗。原因在于：以往的观点认为，手术后放、化疗导致的淋巴细胞减少使得机体免疫功能低下，在这种状态下进行主动免疫，可能不能刺激机体产生免疫正应答，反而容易产生免疫负应答，造成对肿瘤的免疫耐受，所以，很少在淋巴细胞减少状态下开展主动免疫生物治疗。然而，近年的研究发现，各种非遗传因素导致的淋巴细胞减少状态具有驱动淋巴细胞自稳性增生的潜能，主要表现在，外源输注的初始T细胞能在淋巴细胞减少的受者体内快速、活跃地分裂增殖，称为“淋巴细胞减少驱动的细胞增殖”（lymphopenia-driven proliferation，LDP）；在此期间，淋巴细胞数目发生动态性改变，细胞表面分子表达发生变化，获得了活化或记忆样表型。由于初始T细胞可以在淋巴细胞减少状态下活跃地分裂增殖，提示淋巴细胞减少状态下的淋巴细胞对抗原的刺激可能不会发生免疫负应答，相反地，容易诱生免疫正应答。因此，我们推测，肿瘤患者放、化疗后诱导的淋巴细胞减少，其体内残存的淋巴细胞可能同样存在着淋巴细胞减少状态下的活化增殖，有利于免疫应答产生，更可能是肿瘤疫苗免疫治疗的最佳时机。为此，在本研究中，我们以化疗肺癌患者以及化疗小鼠动物模型为切入点，通过观察化疗后体内淋巴细胞数量、不同免疫细胞亚群的比例变化，验证是否存在“淋巴细胞减少及后续细胞活化增殖（lymphopenia setting）”现象；在此基础上，以肿瘤疫苗免疫，通过体内免疫保护和体外功能检测实验，观察在淋巴细胞减少状态下是否能诱生免疫正应答以及对免疫效果的影响；更进一步，对其可能作用机制进行探讨，并对其潜在的临床应用前景提供理论基础。1．肺癌化疗患者和化疗小鼠存在lymphopenia setting现象淋巴细胞减少症（lymphopenia）是指机体外周淋巴细胞绝对总数的减少，具体表现在：成人淋巴细胞总数＜1000／μl，儿童（2岁以下）＜3000／μl。淋巴细胞减少可以由遗传和非遗传因素导致，后者为临床常见，如淋巴细胞减少症在感染性疾病主要是以CD4+T细胞减少的艾滋病为代表；在肿瘤则多见于放、化疗后引起的淋巴细胞减少。淋巴细胞减少后，机体为了维持自身免疫稳定，发生免疫自稳性增生，初始T细胞活跃地分裂增殖，最后达到淋巴细胞减少前的正常水平，这个过程称为“淋巴细胞减少驱动的细胞增殖”（Lymphopenia-drivenproliferation，LDP），我们将淋巴细胞数目从减少到回复的整个时期定义为“lymphopenia setting”。为了观察肺癌患者化疗后是否存在lymphopenia setting及相应的免疫学特性变化，我们对23人次的肺癌患者化疗后外周血免疫细胞数量及各淋巴细胞亚群比例进行了检测。结果表明，肺癌患者化疗后的白细胞、中性粒细胞和淋巴细胞数量均呈现先下降后回复的过程，历时10天左右，其中在第4-6天，淋巴细胞数量下降至最低点，均小于1000／μl，表明化疗患者存在lymphopenia setting现象。同时，我们以流式细胞术对CD8+、CD4+、CD4+CD25-以及CD4+CD25+T细胞亚群比例进行检测。结果发现：随着淋巴细胞数目发生改变，CD8+T细胞的比例检测显示没有明显变化，而CD4+T细胞的比例随之发生改变，表现为先降低后回复的过程，与淋巴细胞数量的改变相一致；进一步，CD4+T细胞中的CD4+CD25-T细胞比例没有发生明显变化，而CD4+CD25+T细胞比例呈现降低后回复的趋势，提示在CD4+T细胞的比例改变中，主要是以CD4+CD25+T细胞的比例改变为主。综合上述结果：肿瘤化疗患者经历了淋巴细胞数量减少，且CD4+T和CD4+CD25+T淋巴细胞亚群比例在lymphopenia setting状态下发生显著性改变。为模拟临床，我们用化疗药物在C57BL／6小鼠体内建立了淋巴细胞减少症动物模型。参照临床使用剂量，通过体表面积换算，以150mg／kg单次腹腔注射环磷酰胺（CTX），结果显示：注射后第1天，外周血、脾脏和淋巴结中的淋巴细胞数显著下降，第4天下降至最低谷，仅为正常数量的10％左右，随后淋巴细胞数量缓慢上升，至第7-10天恢复至正常水平，呈现典型的lymphopenia setting现象。FACS分析各淋巴细胞亚群的比例也与临床结果一致，即CD4+T和CD4+CD25+T细胞亚群比例随着淋巴细胞数量的改变而发生相应的变化，而CD4+CD25-和CD8+T细胞亚群比例则基本保持不变。为说明这些结果并不是环磷酰胺特定药物的特定作用，我们以另一临床常见的肺癌化疗药物—泰素帝（Taxotere）40mg／kg单次处理C57BL／6小鼠，获得了与环磷酰胺处理相同的结果。表明：1)化疗药物处理后呈现的lymphopenia setting并非某一特定药物的特定作用，是化疗药物作用后的普遍现象；2)成功地建立了能反映临床化疗后淋巴细胞减少症的化疗小鼠动物模型，为开展后续的lymphopenia setting状态下的免疫应答研究奠定基础。2、Lymphopenia setting对肿瘤疫苗诱导抗肿瘤免疫的影响Lymphopenia setting现象反映出机体具有淋巴细胞自稳性增生的潜能，为证实这种潜能是否对外界抗原刺激产生特异性免疫应答，我们以小鼠Lewis肺癌细胞株3LL的CTL表位MUT-1荷载于DC表面制成肿瘤疫苗，在化疗小鼠淋巴细胞数量减少的最低点（第4天）主动免疫，于免疫后7天用3LL肿瘤细胞攻击，从体内、体外观察小鼠肿瘤生长及生存、免疫应答的特异性增殖、杀伤及细胞因子分泌等功能。结果显示，化疗小鼠经肿瘤疫苗免疫后，诱生了有效的免疫应答，致敏淋巴细胞不仅对MUT-1特异性抗原肽的体外刺激具有增殖反应，而且对母本3LL细胞的刺激亦具有显著的增殖效应；反应上清中细胞因子IFNγ的分泌水平和体外特异性杀伤功能也呈现相同结果，提示肿瘤疫苗免疫化疗小鼠能诱生有效的免疫正应答。更令人兴奋的结果是，与未经历lymphopenia setting的正常小鼠肿瘤疫苗免疫效果相比较，化疗小鼠诱生了增强的淋巴细胞特异性增殖、杀伤和细胞因子分泌功能（P＜0.05），显著抑制了肿瘤的体内生长（P＜0.05），所有化疗小鼠经历主动免疫后对肿瘤细胞的攻击具有抵抗作用，未见肿瘤生长，并长期存活（P＜0.05）。为排除该保护性效应可能由于化疗药物的直接作用引起，我们设立了单纯使用化疗药物的对照组，结果发现体内、外均未能诱生免疫应答及保护效应；其次，为排除化疗药物对肿瘤疫苗的间接修饰作用，以化疗药物作用后第4天（淋巴细胞数量减少的最低点）的小鼠血清体外与DC-MUT1肿瘤疫苗孵育，随后主动免疫正常小鼠，观察肿瘤生长，结果发现：与未进行血清处理的DC-MUT1肿瘤疫苗结果相似，血清处理肿瘤疫苗不具有完全保护效应。提示DC-MUT1肿瘤疫苗在化疗小鼠体内诱生的免疫应答以及增强的免疫效果主要与淋巴细胞减少及后续的免疫细胞在外来抗原刺激下的活跃增殖相关。进一步，为更好地模拟临床肿瘤患者化疗诱生lymphopenia setting的免疫功能改变，我们首先以3LL肿瘤细胞接种C57BL／6小鼠，造成荷瘤状态，再按常规给予化疗药物泰素帝（Taxotere），随后给予3LL-GM（3LL转染GM-CSF）肿瘤疫苗，体内观察其生存情况，体外检测小鼠的免疫功能。结果发现：荷瘤小鼠在化疗诱生的lymphopenia setting下应用肿瘤疫苗免疫，获得了明显优于未经历lymphopenia setting小鼠的免疫应答，70％的荷瘤小鼠在化疗和肿瘤疫苗的作用下成功地使肿瘤消退，其余30％荷瘤小鼠的肿瘤生长速度明显减缓，而仅应用肿瘤疫苗或化疗的小鼠均不能使荷瘤小鼠的肿瘤消退以及延长小鼠的生存时间，二者相比较具有显著性差异（P＜0.05）。进一步，对存活小鼠以3LL母本肿瘤细胞再攻击，所有小鼠均无肿瘤发生，提示存活小鼠获得了特异性免疫记忆功能。体外通过检测细胞内细胞因子IFNγ的表达同样证实3LL-GM肿瘤疫苗在化疗小鼠体内诱生了特异性的细胞免疫应答。说明荷瘤小鼠在淋巴细胞减少状态下进行肿瘤疫苗的主动免疫可以获得有效的抗肿瘤免疫应答，最终使肿瘤消退，并维持小鼠长期存活。3、Lymphopenia setting增强抗肿瘤效应的可能机制研究在这部分研究内容中，我们对lymphopenia setting诱生增强的肿瘤免疫应答机制进行了探讨，我们发现，调节性T细胞在其中发挥关键的作用。首先，通过比较未进行化疗的32例肿瘤患者与23例化疗肿瘤患者外周血中的调节性T细胞比例，我们发现，未进行化疗的临床手术病人外周血及肿瘤浸润淋巴细胞中CD4+CD25+Foxp3+调节性T细胞的比例显著高于正常对照（P＜0.05），表明肿瘤患者的Treg比例是升高的。而肿瘤化疗患者，化疗后的CD4+CD25+Foxp3+调节性T细胞的比例呈现显著下降，但是，CD4+CD25+T、CD8+T细胞亚群的比例不变，说明lymphopenia setting可以选择性地下调Treg亚群比例，从而减少对CD8+T细胞效应功能发挥的抑制。其次，在动物模型中，根据化疗后小鼠体内Treg的动态变化，我们分别在化疗后第1、4、7天给予肿瘤疫苗免疫，随后进行肿瘤细胞攻击。结果显示：在调节性T细胞亚群比例最低点（第4天）给予肿瘤疫苗，诱导出最佳的免疫应答，所有小鼠均获得完全的保护效应，并长期存活；而在Treg亚群比例较高的第1和7天给予肿瘤疫苗，没有获得免疫保护效应，提示Treg亚群比例的升高与未诱导出有效的免疫保护效应之间存在相关性，表明Treg参与了淋巴细胞减少症下的免疫负调控。最后，在荷瘤小鼠的lymphopenia setting状态下进行肿瘤疫苗免疫的实验中，我们以抗CD8+T细胞亚群的单克隆抗体注射化疗小鼠，清除体内的CD8+T细胞亚群，结果发现所有小鼠的肿瘤呈进行性快速生长，提示CD8+T细胞亚群介导的细胞免疫应答在抗肿瘤免疫应答中的重要性。然而，当我们以抗CD4+T细胞亚群的单克隆抗体注射化疗小鼠，清除体内的CD4+T细胞亚群，结果发现：100％荷瘤小鼠发生了肿瘤消退，其效果显著优于未进行CD4+T细胞亚群的抗体清除实验组，由于清除CD4+T亚群可以认为同时清除了CD4+CD25+T亚群，所以该现象可能与CD4+CD25+Foxp3+调节性T细胞的抑制功能被解除相关，从功能上阐明lymphopenia诱生的Treg亚群比例减少增强了特异性的免疫应答效应。综上所述，本研究以化疗诱生的lymphopenia setting为切入点，发现lymphopenia setting状态下肿瘤疫苗的主动免疫不仅不会诱导机体的免疫耐受，而且诱导出增强的抗肿瘤免疫应答效应。更为重要的是，我们证实lymphopenia setting诱导的免疫增强作用与调节性T细胞在lymphopenia setting状态下的比例减少相关，部分修正了以往认为lymphopenia setting诱导免疫应答主要是以增加细胞增殖的空间或享有更多的促淋巴细胞生长的细胞因子资源而发挥作用的观点。本研究为淋巴细胞减少状态下的细胞活跃增殖的机制研究提供新思路，为临床肿瘤化疗患者开展肿瘤疫苗的主动免疫生物治疗制定新策略，具有潜在的应用前景。

论文目录

• 中文摘要
• 英文摘要
• 正文
• 前言
• 第一部分 肿瘤化疗患者和化疗小鼠中存在lymphopenia setting现象
• 材料和方法
• 结果
• 讨论
• 第二部分 Lymphopenia setting对肿瘤疫苗诱导抗肿瘤免疫的影响
• 材料和方法
• 结果
• 讨论
• 第三部分 Lymphopenia setting增强抗肿瘤免疫的可能机制研究
• 材料与方法
• 结果
• 讨论
• 小结
• 参考文献
• 附录
• 致谢
• 综述
• 参考文献