莲子β-葡萄糖苷酶特性及其对荷叶饮料增香作用的研究

论文摘要

β-葡萄糖苷酶（EC 3．2．1．21），属于水解酶类，能够水解结合于未端、非还原性的β-D-糖苷键，同时释放β-D-葡萄糖和相应的配基，是植物中醇系香气形成的关键酶类。近年来，对于β-葡萄糖苷酶的相关研究很多，但对于水生植物来源的β-葡萄糖苷酶却鲜有报导。本文首次对莲子中β-葡萄糖苷酶的提取、酶活性分析条件以及分离纯化、酶学性质做了初步研究。并尝试将莲子β-葡萄糖苷酶应用于荷叶饮料中，结合顶空固相微萃取法（HS-SPME）和气相-质谱联用仪（GC-MS）对荷叶饮料的香气成分及莲子β-葡萄糖苷酶对其增香效果进行了研究。主要实验结果如下：1莲子β-葡萄糖苷酶酶活性分析和提取条件本文采用pNPG法测定β-葡萄糖苷酶的活性。特征吸收波长、反应时间、温度和反应的缓冲液的pH值都会对β-葡萄糖苷酶活性的测定产生一定的影响。通过实验确定的最佳酶活测定条件为：测定波长：400nm；反应pH值：5．0；反应温度：56℃；反应时间：60min。按此方法测得新鲜莲子的酶活为1．78U／g，而干燥后的莲子酶活仍然有1．26U／g（两者均为折算为每克新鲜莲子酶活）。在酶液的提取过程中，缓冲液的种类和pH值对酶活有着很大的影响，本文实验表明在提取莲子中β-葡萄糖苷酶时使用pH6．0的柠檬酸-磷酸氢二钠缓冲液效果较好，在酶的提取过程中样品与PVPP的最适比为5：1。2莲子β-葡萄糖苷酶的分离纯化莲子β-葡萄糖苷酶的硫酸铵盐析范围为50％-70％的饱和度，这个分级范围内包含有87．6％的酶活力。选用DEAE-52纤维素进行离子交换柱层析，选择分别含0mol／L、0．1mol／L NaCl和0．3 mol／L NaCl的pH 8．5的Tris-HCl缓冲液为洗脱液做梯度洗脱。经此离子交换柱层析后，纯化倍数为18．28，比酶活力达到286．67×10-3U／mg。再经Sephadex G-100纯化，纯化倍数可达32．57倍，比酶活力达到510．83×10-3U／mg，不过，经过一系列纯化过程后，酶的总活力大幅度下降，酶的得率仅为1．29％。3莲子β-葡萄糖苷酶的酶学性质莲子β-葡萄糖苷酶的最适反应温度为56℃，最适pH为5．0。热稳定性实验表明酶在30-50℃下较稳定，保温150min后仍然有较高的酶活；保存稳定性实验表明，在4℃低温下酶的稳定性较好，保存半个月后，其相对活性仍然可以达到91％；而pH稳定性实验表明在pH 5．0到7．0之间，酶较稳定且酶活最大，在碱性条件下酶活和稳定性均大幅度下降。酶对底物pNPG的米氏常数Km值为2．281mmol／L，最大反应速率Vmax为2．308 U／L。SDS-PAGE电泳实验表明莲子β-葡萄糖苷酶可能由两个亚基组成，其分子量分别为39．2KDa和30．1KDa。在低浓度环境下，Ca2+、Mg2+、Al3+、Zn2+对酶活几乎无影响，Mg2+在浓度为4．0 mmol／L的时候则能明显地促进酶活；Al3+和Zn2+在浓度高于6．0 mmol／L的时候，能显著地抑制酶活。Vc和半胱胺酸盐酸盐在低浓度（10mmol／L以下）条件下对酶活有很微弱的促进作用。氯化钠和亚硫酸钠对酶活的抑制作用均很明显，且浓度越大，抑制作用越强。4莲子β-葡萄糖苷酶对荷叶饮料的增香作用采用HS-SPME对荷叶饮料香气成分进行提取时，最佳萃取条件为：萃取温度50℃，萃取时间60min，顶空体积40ml。GC-MS分析结果表明荷叶饮料中香气的主要成分为醛类、酮类、醇类，他们占总香气成分的比例分别为19．69％、16．24％、6．25％。莲子β-葡萄糖苷酶对荷叶饮料确实有一定的增香作用，经过酶处理过后的荷叶饮料总香气成分增加了约12％，其中醛类、酮类、醇类这三类主要成分的在总香气中的相对含量变为17．18％、16．54％、8．82％。此外，酶处理对香气中酯类物质含量影响很大，经过酶处理后其在总香气中的相对含量由3．21％上升至7．64％。由于这些香味物质的增加，经过酶处理后的荷叶饮料香气更浓，气味更加柔和。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 第一章 文献综述
• 1 β-葡萄糖苷酶的研究进展
• 1.1 β-葡萄糖苷酶的发现、来源与分类
• 1.2 β-葡萄糖苷酶酶活的测定方法
• 1.3 β-葡萄糖苷酶的提取与分离纯化
• 1.4 β-葡萄糖苷酶的理化性质
• 1.4.1 β-葡萄糖苷酶的分子量
• 1.4.2 β-葡萄糖苷酶的最适温度及热稳定性
• 1.4.3 β-葡萄糖苷酶的pI、最适pH及pH稳定性
• 1.4.4 β-葡萄糖苷酶的底物特异性
• 1.4.5 β-葡萄糖苷酶的反应机制和活性中心结构
• 1.5 β-葡萄糖苷酶的应用研究进展
• 1.5.1 β-葡萄糖苷酶在食品增香中的应用
• 1.5.2 β-葡萄糖苷酶在生产大豆异黄酮活性苷元中的应用
• 1.5.3 利用β-葡萄糖苷酶的水解纤维素
• 2 本文研究目的及意义
• 第二章 莲子中β-葡萄糖苷酶提取及测定条件的确定
• 1 材料与试剂
• 1.1 实验材料
• 1.2 主要试剂
• 1.3 主要仪器
• 2 实验方法
• 2.1 β-葡萄糖苷酶粗酶液提取
• 2.2 β-葡萄糖苷酶活性的测定
• 2.2.1 对硝基苯酚标准曲线的绘制及反应最大吸收波长的确定
• 2.2.2 β-葡萄糖苷酶活性测定
• 2.2.3 β-葡萄糖苷酶活性的计算
• 2.3 β-葡萄糖苷酶分析条件的优化
• 2.3.1 反应温度对酶活的影响
• 2.3.2 反应时间对酶活的影响
• 2.3.3 反应体系pH值对酶活的影响
• 2.3.4 干燥处理对莲子酶活的影响
• 2.4 β-葡萄糖苷酶提取条件的优化
• 2.4.1 提取缓冲液pH值及缓冲液种类对酶活的影响
• 2.4.2 提取过程中PVPP加入量对酶活的影响
• 3 实验结果与分析
• 3.1 对硝基苯酚标准曲线的绘制及反应最大吸收波长的确定
• 3.2 反应温度对酶活的影响
• 3.3 最佳反应时间的确定
• 3.4 酶促反应环境pH值对酶活的影响
• 3.5 干燥处理对莲子酶活的影响
• 3.6 提取缓冲液种类及相应pH的选择
• 3.7 提取过程中PVPP加入量对酶活的影响
• 4 讨论与结论
• 4.1 讨论
• 4.1.1 提取过程中各因素对酶活的影响
• 4.1.2 莲子β-葡萄糖苷酶与其它来源β-葡萄糖苷酶的差异比较
• 4.2 结论
• 4.2.1 β-葡萄糖苷酶活性分析条件
• 4.2.2 莲子β-葡萄糖苷酶的提取条件
• 第三章 莲子中β-葡萄糖苷酶分离纯化及其酶学性质初步研究
• 1 材料与试剂
• 1.1 实验材料
• 1.2 主要试剂
• 1.3 主要仪器
• 2 实验方法
• 2.1 β-葡萄糖苷酶活性测定
• 2.2 β-葡萄糖苷酶的分离纯化
• 2.2.1 β-葡萄糖苷酶硫酸铵分级沉淀
• 2.2.2 β-葡萄糖苷酶的透析脱盐、浓缩
• 2.2.3 β-葡萄糖苷酶的DEAE-52纤维素柱层析
• 2.2.4 β-葡萄糖苷酶的Sephadex G-100柱层析
• 2.3 蛋白质含量的测定
• 2.4 β-葡萄糖苷酶分子量的测定
• 2.5 酶水解pNPG动力学常数Vmax和Km的测定
• 2.6 抑制剂、促进剂对酶活性的影响
• 2.6.1 常见抑制剂对酶活性的影响
• 2.6.2 常见促进剂对酶活性的影响
• 2.7 金属离子对酶活性的影响
• 2.8 酶的热稳定性研究
• 2.9 酶的pH稳定性研究
• 2.10 酶的保存稳定性
• 3 实验结果与分析
• 3.1 β-葡萄糖苷酶的硫酸铵分级沉淀
• 3.2 β-葡萄糖苷酶的DEAE-52纤维素柱层析纯化
• 3.3 β-葡萄糖苷酶的Sephadex G-100柱层析
• 3.4 莲子β-葡萄糖苷酶纯化过程总表
• 3.5 莲子β-葡萄糖苷酶分子量的测定
• 3.6 酶水解pNPG动力学常数的测定
• 3.7 抑制剂、促进剂对酶活性的影响
• 3.7.1 抑制剂对酶活性的影响
• 3.7.2 促进剂对酶活性的影响
• 3.8 金属离子对酶活性的影响
• 3.9 酶的热稳定性
• 3.10 酶的pH稳定性
• 3.11 酶的保存稳定性
• 4 讨论与结论
• 4.1 讨论
• 4.1.1 对莲子β-葡萄糖苷酶分离纯化过程的讨论
• 4.1.2 对莲子β-葡萄糖苷酶酶学性质的讨论
• 4.2 结论
• 4.2.1 莲子β-葡萄糖苷酶的分离纯化
• 4.2.2 莲子β-葡萄糖苷酶的基本酶学性质
• 第四章 莲子β-葡萄糖苷酶对荷叶饮料增香作用的研究
• 1 材料与试剂
• 1.1 实验材料
• 1.2 主要试剂
• 1.3 主要仪器及设备
• 2 实验方法
• 2.1 荷叶汤汁的制备
• 2.2 荷叶汁的酶处理
• 2.3 香气成分的提取
• 2.4 HS-SPME条件的选择
• 2.4.1 萃取温度对萃取效果的影响
• 2.4.2 萃取时间对萃取效果的影响
• 2.4.3 样品体积和顶空体积对萃取效果的影响
• 2.5 香气成分的GC分析
• 2.6 香气成分的GC-MS分析
• 2.7 谱图分析
• 3 实验结果及分析
• 3.1 HS-SPME萃取条件的优化
• 3.1.1 萃取温度对萃取效果的影响
• 3.1.2 萃取时间对萃取效果的影响
• 3.1.3 顶空体积对萃取效果的影响
• 3.2 GC-MS分析荷叶饮料香气成分及β-葡萄糖苷酶对其增香作用
• 4 讨论与结论
• 4.1 讨论
• 4.2 结论
• 参考文献
• 致谢