编码hTERT基因慢病毒载体的构建及其介导的DC疫苗抗肿瘤活性的研究

论文摘要

目的:构建编码人端粒酶逆转录酶（Human Telomerase ReverseTranscriptase,hTERT）的慢病毒载体,研究其介导的hTERT修饰的树突细胞（dendritic cell,DC）疫苗诱导的细胞毒性T细胞（cytotoxic T lymphocyte,CTL）对肿瘤的杀伤作用。方法:1)以肝癌细胞株HepG2的mRNA作为模板,采用RT-PCR方法扩增出hTERT基因片段;应用T-A克隆技术进一步扩增纯化该基因片段;通过BamHⅠ和XhoⅠ限制性内切酶将hTERT基因片段从T载体上切下,并连接到质粒L166中构建重组质粒L166-hTERT。2)大量提取重组质粒L166-hTERT和包装质粒L205、包膜蛋白质粒L311,采用CaCl2法将此三个质粒共同转染慢病毒包装细胞293T,72h后收集病毒上清,0.45μm负压过滤得到hTERT基因修饰的慢病毒颗粒Lenti-hTERT;同样方法获得编码绿色荧光蛋白（Green Flrorescence Protein,GFP）的慢病毒颗粒Lenti-GFP。3)将收获的慢病毒颗粒Lenti-GFP以不同浓度感染293T细胞,荧光显微镜下计数绿色荧光的量,由此计算该病毒的滴度和对293T细胞的感染率;采用细胞免疫化学技术鉴定Lenti-hTERT感染的293T细胞中hTERT基因的表达。4)从脐血中分离出单个核细胞,rhGM-CSF、rhIL-4和rhTNF—α诱导获得DC,通过相差显微镜和流式细胞仪进行形态和表型鉴定。5)Lenti-hTERT感染DC构建DC疫苗,MTT法检测DC疫苗刺激同种T淋巴细胞的增殖能力和其诱导的特异性CTL对端粒酶阳性的肿瘤细胞的杀伤能力。结果:1)通过酶切电泳、PCR扩增和测序证实hTERT基因已克隆到质粒L166中。2)显微镜下观察到产毒的293T细胞肿胀变大,与培养瓶壁的黏附力下降,产Lenti-GFP的293T细胞培养到第3天在荧光显微镜下可见到大量绿色荧光。3)收集的慢病毒颗粒感染293T细胞,测得病毒滴度为5.88×106IU/mL;转染率约90%;hTERT基因在293T细胞中持续表达超过2个月。4)由脐血获得的单个核细胞,培养3～5天后有大量细胞悬浮生长,形态不规则,相差显微镜下可见细胞有伸展的大量毛刺,为典型的DC形态;流式细胞仪检测（Flow Cytometry,FCM）结果显示其高表达DC表面分子标记。5)hTERT修饰的DC疫苗刺激同种T淋巴细胞的增殖能力和抗肿瘤活性均较未感染者明显增强（P＜0.01）。结论:1)成功制备了hTERT基因修饰的慢病毒载体,该慢病毒的滴度和对靶细胞的转染率均较高,且慢病毒携带的hTERT基因可以在靶细胞内持续高水平表达。2)成功从脐血中分离并诱导出DC,通过相差显微镜观察和流式细胞仪检测证实。3)慢病毒Lenti-hTERT感染DC制备的DC疫苗刺激同种T淋巴细胞增殖的能力和其诱导的CTL对肿瘤细胞的杀伤能力均显著增强。

论文目录

• 中文摘要
• 英文摘要
• 中英文对照缩略语
• 前言
• 第一部分 编码hTERT基因慢病毒的包装及鉴定
• 材料与方法
• 结果
• 讨论
• 第二部分 hTERT基因修饰的DC疫苗的构建及其诱导的CTL对肿瘤细胞杀伤活性的检测
• 材料与方法
• 结果
• 讨论
• 附图表
• 结论
• 参考文献
• 综述
• 致谢
• 攻读学位期间发表的论文
• 学位论文评阅及答辩情况表