猪抗PRRSV相关基因的鉴定及功能分析

论文摘要

猪繁殖与呼吸综合症（Porcine reproductive and respiratory syndrome , PRRS）是由猪繁殖与呼吸综合症病毒（PRRSV）引起的一种病毒性传染病。PRRS导致妊娠母猪严重繁殖障碍,仔猪高死亡率以及各年龄段尤其仔猪的呼吸道疾病。PRRSV的基因组是高度可变的,由于这种变异,没有有效的疫苗可以利用,即使是接种疫苗,仍有部分猪感染PRRSV,因此培育具有抗PRRSV的猪是解决这一难题的切实可行的途径。本研究利用基因表达谱芯片技术对大蒲莲猪和杜-大-长商品猪感染PRRSV后肺脏组织基因表达谱差异进行了研究。在候选基因的研究上,我们对猪干扰素受体（IFNGR1, IFNAR2）进行了克隆,分析了IFNGR1、IFNAR2 mRNA在猪不同组织中的表达及PRRSV感染对其mRNA表达的影响。主要结果如下:1.对6周龄的大蒲莲猪及杜-大-长商品猪进行人工攻毒,试验组鼻内接种PRRSV标准毒株（JXA1）,对照组鼻内接种PBS。攻毒后每天直肠测量体温,攻毒后0 d、4 d、7 d、14 d、21 d、28 d称量体重、采血并测定细胞因子（IL-1β、IL-2、IL- 10、IFN-γ和INF-a）,免疫球蛋白IgG等指标并进行血细胞计数。对攻毒4 d、7 d、14 d、21 d和28 d血清中的PRRSV进行RT-PCR及绝对real - time PCR的检测,结果表明,攻毒0 - 28 d,大蒲莲猪没有出现比较明显的临床症状;杜-大-长商品猪则表现出比较明显的临床症状和病理变化:临床症状有发烧（体温高达42℃）、耳部皮肤发绀、出现红斑、眼睑水肿、打喷嚏、呼吸急促,嗜睡等,解剖病理学变化有肺间质增宽、肺水肿,肺脏表面有大小不等,程度不同的出血和淤血;气管、支气管出血,淋巴结水肿、出血;脾脏变硬,有出血点,肺萎缩及胸部积水。攻毒0 d - 14 d,大蒲莲猪,血清中TNF-α含量显著升高,血清IL-10的含量变化则不同,14 d时大蒲莲猪仍维持较高的水平,而杜-大-长商品猪则下降;在大蒲莲猪和杜-大-长商品猪中,血清IFN-γ的变化呈现先降后升的动态特征,IgG的含量随时间变化呈现上升趋势,都在14 d达到最高峰。血细胞计数分析结果表明攻毒后,部分大蒲莲猪和杜-大-长商品猪白细胞总数偏低或升高,其它指标基本没有变化。RT-PCR及绝对real - time PCR的检测结果表明,大蒲莲猪血清中PRRSV的含量低于杜-大-长商品猪。2.利用表达谱芯片分析了大蒲莲猪及杜-大-长商品猪感染PRRSV后肺脏组织差异基因表达的情况,找到了259个差异表达的基因,其中上调基因105个,下调基因154个,聚类分析表明大蒲莲猪具有相似的表达模式,先聚在一类,杜-大-长商品猪具有相似的表达模式,聚在另一类。GO分析表明差异表达基因主要参与细胞生物学过程,生理学过程,发育过程,生物调节过程和免疫系统等生物学过程。对其中的12个基因进行了real–time PCR的验证,有11个基因与基因芯片结果一致,其中上调基因6个,分别是:ENPEP、TF、USP18、Scarb2、CACNA2D1和CYP3A29基因,下调基因5个,分别是:GSTA2,CYP3A88、ATP1B1,LPL和MRC1基因。其中,CYP3A29、USP18、IF和ENPEP的mRNA表达水平,大蒲莲猪分别是杜-大-长商品猪的9.09、7.10、6.24和5.43倍,而CYP3A88和GSTA2的mRNA的表达水平,大蒲莲猪仅为杜-大-长商品猪的1 %和4 %。通过对攻毒前后大蒲莲猪和杜-大-长商品猪上述基因表达水平的对比分析,初步确定ENPEP、TF、USP18、CYP3A29等为与猪对PRRSV的抗性有关的基因,CYP3A88、GSTA2等为与猪对PRRSV的易感性有关的基因。3.通过RT-PCR及5′-和3′-RACE,我们得到了猪IFNGR1基因完整的cDNA序列,得到两个转录本,这两个转录本只是具有5′-UTR的不同。猪IFNGR1基因核苷酸序列与小鼠,大鼠,人和牛的同源性分别是63.73 %, 62.95 %, 72.90 %和81.10 %。猪IFNGR1基因氨基酸序列与小鼠,大鼠,人和牛的同源性分别是46.69 %, 45.64 %, 58.04 %和72.55 %。猪IFNGR1基因位于1号染色体上,包括7个外显子和6个内含子。对猪IFNGR1基因的mRNA 14种组织表达谱进行了分析,该基因在检测的组织中均表达,其中,脾脏、淋巴结,扁桃体、肝脏的表达相对强一些,小肠,大肠和子宫中的表达量弱一些。对莱芜猪、杜洛克猪成年猪及仔猪5种组织中IFNGR1基因mRNA的表达情况进行了real-time PCR的分析。结果表明在不同品种、不同组织中IFNGR1基因mRNA的表达情况存在差异。为了研究PRRSV对猪IFNGR1基因mRNA表达的影响,我们选择了大蒲莲猪和杜-大-长商品猪的肺脏,脾脏和淋巴结进行了研究。在大蒲莲猪感染PRRSV后,肺脏IFNGR1基因mRNA的表达量显著上调（P<0.05）,然而,淋巴结IFNGR1基因mRNA的表达量显著下调（P<0.05）。在杜-大-长商品猪感染PRRSV后,肺脏,脾脏,淋巴结的表达量有一定的变化,但是没有达到显著水平（P>0.05）。4.通过RT-PCR和5′-RACE技术,我们获得了猪IFNAR2 cDNA序列,大小为2882 bp,猪IFNAR2基因包括9个外显子和8个内含子,其氨基酸序列与小鼠、人、绵羊和牛的同源性分别是38.18 %、55.29 %、62.01 %和63.39 %。猪IFNAR2基因14种组织中mRNA的表达的相对量被检测,该基因在检测的组织中均表达,其中,脾脏、小肠、大脑和子宫中的表达相对强一些,胃中的表达量相对弱一些。我们对莱芜猪、杜洛克猪成年猪及仔猪5种组织中IFNAR2基因mRNA的表达情况进行了real-time PCR的分析,结果表明不同品种、不同组织中IFNAR2基因mRNA表达水平存在差异。在大蒲莲猪中,与非感染的对照组相比,感染PRRSV后,肺脏、脾脏和淋巴结IFNAR2 mRNA的表达量没有显著差异（P>0.05）;在杜-大-长商品猪中,与非感染的对照组相比,感染PRRSV后,肺脏IFNAR2 mRNA的表达量显著下调（P<0.05）。综上所述,本研究对大蒲莲猪抗PRRSV的机理进行了探讨。结果显示,大蒲莲猪和杜-大-长商品猪对PRRSV反应不同,在PRRSV感染后肺组织中表达的基因具有较大差异。首次克隆了猪IFNGR1和IFNAR2基因并对其组织表达进行了分析,证明PRRSV感染后这两个基因分别在大蒲莲猪和杜-大-长商品猪淋巴结和肺以及肺组织中的表达水平存在差异。本研究找到了一些肺组织中表达,与猪对PRRSV的抗性和易感性有关的基因,为进一步探讨猪PRRS的发病机理以及找到与猪抗PRRSV有关的分子标记奠定了基础。

论文目录

• 中文摘要
• ABSTRACT
• 1 前言
• 1.1 猪繁殖与呼吸综合症
• 1.1.1 PRRSV 的分类及理化性质
• 1.1.2 PRRS 的临床症状和病理变化
• 1.1.3 PRRSV 的致病机理
• 1.1.4 PRRSV 的受体
• 1.1.5 猪繁殖与呼吸综合症生物学特征
• 1.1.6 PRRSV 的血清学诊断和分子诊断
• 1.1.7 PRRS 免疫学研究
• 1.1.8 PRRS 的流行病学研究
• 1.2 干扰素受体的研究概况
• 1.2.1 I 型干扰素受体
• 1.2.2 II 型干扰素受体
• 1.3 基因芯片技术及其应用
• 1.3.1 基因芯片的定义
• 1.3.2 基因芯片工作原理
• 1.3.3 基因芯片数据的基因注释和功能分析
• 1.4 猪对PRRSV 抗性差异的研究进展
• 1.5 本研究的目的意义
• 2 材料与方法
• 2.1 试验材料
• 2.1.1 仔猪及攻毒场所
• 2.1.2 试验动物及样品采集
• 2.1.3 毒株
• 2.1.4 菌株和载体
• 2.1.5 主要仪器
• 2.1.6 主要试剂及来
• 2.1.7 Affymetrix 基因芯片
• 2.1.8 主要数据库及生物软件
• 2.2 试验方法
• 2.2.1 常用试剂的配制
• 2.2.2 猪组织中DNA 的提取
• 2.2.3 猪组织总RNA 的提取
• 2.2.4 反转录获得cDNA
• 2.2.5 克隆和测序
• 2.2.6 实时荧光定量PCR（real –time PCR）
• 2.2.7 猪对PRRSV 感染的生物学反应
• 2.2.8 感染PRRSV 后猪肺组织基因表达谱的对比分析
• 2.2.9 猪IFNGR1 基因cDNA 序列的克隆及mRNA 表达特征
• 2.2.10 猪IFNAR2 基因的克隆及mRNA 表达特征
• 2.3 统计分析
• 3 结果与分析
• 3.1 猪对PRRSV 感染的生物学反应的比较
• 3.1.1 杜-大-长商品猪感染PRRSV 后的临床症状、体温、体重及解剖病理变化
• 3.1.2 大蒲莲猪感染PRRSV 后的临床症状、体温、体重及解剖病理变化
• 3.1.3 PRRSV 对细胞因子和免疫球蛋白IGG 蛋白质水平的影响
• 3.1.4 PRRSV 对CD4+ 、CD8+ T 淋巴细胞及CD4+/CD8+比值的影响
• 3.1.5 血细胞计数分析结果
• 3.1.6 血清中PRRSV 的RT-PCR 检测结果
• 3.1.7 血清中PRRSV 的绝对REAL - TIME PCR 检测
• 3.2 大蒲莲猪与杜-大-长商品猪肺脏差异表达基因的筛选
• 3.2.1 RNA 的质量鉴定
• 3.2.2 芯片数据分析
• 3.3 猪IFNGR1 基因的克隆及MRNA 表达特征
• 3.3.1 IFNGR1 基因cDNA 的克隆
• 3.3.2 序列同源性与系统发育分析
• 3.3.3 可变剪接和猪IFNGR1 基因的mRNA 组织表达谱
• 3.3.4 莱芜猪、杜洛克猪不同组织IFNGR1 基因mRNA 表达水平的分析
• 3.3.5 PRRSV 感染对猪IFNGR1 基因mRNA 表达的影响
• 3.4 猪IFNAR2 基因的克隆及MRNA 表达特征
• 3.4.1 猪IFNAR2 基因CDNA 的克隆
• 3.4.2 序列同源性与系统发育分析
• 3.4.3 猪IFNAR2 基因的mRNA 组织表达谱分析
• 3.4.4 莱芜猪、杜洛克猪不同组织IFNAR2 基因mRNA 表达水平的分析
• 3.4.5 PRRSV 感染对猪IFNAR2 基因mRNA 表达的影响
• 4 讨论
• 4.1 不同品种的猪对PRRSV 的反应存在差异
• 4.2 猪对PRRSV 抗性差异的可能机制
• 4.3 差异基因的筛选及GO 分析
• 4.4 差异表达基因的验证及分析
• 4.5 猪IFNGR1 基因表达特征及PRRSV 对其表达的影响
• 4.6 IFNAR2 基因MRNA 表达规律及PRRSV 对其表达的影响
• 5 结论
• 6 参考文献
• 7 附录
• 8 致谢
• 9 攻读学位期间发表的学术论文
• 博士学位论文内容简介及自评