生长抑素原核真核双表达质粒的构建与鉴定及作用机理研究

论文摘要

原核真核双表达系统与单一的原核或真核表达系统相比,具有较大的优势,可以同时启动原核和真核双表达外源基因。以减毒猪霍乱沙门氏菌为运载菌的原核真核双表达系统,可以同时在细菌和真核细胞中表达同一蛋白质,且原核表达产物可以刺激机体免疫应答；同样,真核表达质粒在机体中的表达产物也可以刺激机体产生免疫应答反应。因此,理论上原核和真核双表达质粒可以刺激机体提高其免疫应答能力。本研究应用基因克隆、细胞培养、RT-PCR、SDS-PAGE、Western blot和ELISA等技术,将原核启动子Ptrc片段克隆到非抗性筛选生长抑素真核表达质粒pGS/2SS-M4GFP-asd,构建生长抑素原核真核双表达质粒pPtrc-S/2SS-M4GFP-asd,分别转化asd-大肠杆菌χ6097和crp-/asd-双缺失减毒猪霍乱沙门氏菌C500,得到x6097 （pPtrc-S/2SS-M4GFP-asd）和C500 （pPtrc-S/2SS-M4GFP-asd）工程菌。接着对pPtrc-S/2SS-M4GFP-asd质粒和C500 （pPtrc-S/2SS-M4GFP-asd）工程菌进行原核、真核表达鉴定。将重组菌免疫4周龄昆明小鼠,检测小鼠血浆中抗SS抗体和抗C500水平,旨在探讨以减毒猪霍乱沙门氏菌为载体的生长抑素原核真核双表达质粒的免疫效力,为提高现有生长抑素基因疫苗的免疫效果,开发高效、安全的促生长疫苗奠定理论基础,并提供技术支撑。1.生长抑素原核真核双表达质粒pPtrc-S/2SS-M4GFP-asd的构建与筛选人工合成启动子Ptrc序列片段,将其亚克隆入pGS/2SS-M4GFP-asd真核表达质粒CMV启动子下游,成功构建了生长抑素原核真核双表达质粒（pPtrc-S/2SS-M4GFP-asd）;分别转化大肠杆菌X6097和减毒猪霍乱沙门氏菌C500,经双酶切和测序鉴定结果表明,基因的插入位点、方向和序列完全正确,成功得到分别以大肠杆菌x6097 （pPtrc-S/2SS-M4GFP-asd）和减毒猪霍乱沙门氏菌C500 （pPtrc-S/2SS-M4GFP-asd）为载体的工程菌各1株。2.生长抑素原核真核双表达质粒pPtrc-S/2SS-M4GFP-asd的表达与鉴定将构建好的生长抑素工程菌C500 （pPtrc-S/2SS-M4GFP-asd）经异丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷（IPTG）和非IPTG诱导培养3h后,培养物中检出S/2SS-M4GFP融合蛋白,大小为55KDa；用Western blot方法鉴定证明,表达的融合蛋白可与抗生长抑素抗体结合；将生长抑素原核真核双表达质粒pPtrc-S/2SS-M4GFP-asd转染293FT细胞,48h后观察到绿色荧光,RT-PCR检测证实转录产物有S片段（352bp）、S/SS片段（491bp）和S/2SS（795bp）,表明该质粒既可在原核细胞又可在真核细胞中进行表达。3.生长抑素原核真核双表达重组菌免疫对小鼠免疫应答和生长的影响将生长抑素原核真核双表达C500 （pPtrc-S/2SS-M4GFP-asd）工程菌分三个免疫剂量（高剂量0.2×1010CFU/只,中剂量0.2×109CFU/只,低剂量0.2×108CFU/只）免疫雌性昆明小鼠。在整个实验阶段,高剂量组增重分别比中剂量组、低剂量组和真核对照组（pGS/2SS-M4GFP-asd）提高5.5%、8.2%和7.1%,但组间差异不显著（P>0.05）,且高剂量组料肉比最低（25.9：1）。初免后3w高剂量组产生了高于真核对照组6.7%的IgG抗体效价；加强免疫后高剂量组IgG抗体效价比真核对照组提高8.2%。初免后3w高剂量组比真核对照组IgG1抗体效价提高25%,但IgG1>IgG2a,表明免疫疫苗菌后机体倾向于产生Th2型免疫应答,以介导体液免疫反应为主。由此说明,生长抑素原核真核双表达质粒pPtrc-S/2SS-M4GFP-asd与生长抑素基因疫苗pGS/2SS-M4GFP-asd相比,能够引起更强的免疫应答反应尤其是体液免疫反应,从而更好地促进机体生长。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 缩略语表
• 第一章 文献综述
• 1 生长抑素基因疫苗研究进展与存在的主要问题
• 1.1 生长抑素基因疫苗对动物的免疫效力研究
• 1.2 生长抑素基因疫苗的安全性研究
• 1.3 生长抑素基因疫苗存在的问题
• 2 原核真核双表达系统的研究进展
• 2.1 原核、真核单表达系统的特点
• 2.2 原核真核双表达系统的类型
• 2.3 原核真核双表达系统作用机理推测
• 2.4 原核真核双表达基因疫苗的研究进展
• 3 启动子的研究进展
• 3.1 原核启动子类型
• 3.2 真核启动子类型
• 3.3 启动子增强外源基因的表达
• 4 本研究的目的与意义
• 第二章 生长抑素原核真核双表达质粒的构建和筛选
• 1 前言
• 2 材料
• 2.1 质粒、菌株与细胞
• 2.2 工具酶及试剂
• 2.3 仪器设备
• 2.4 试剂的配制
• 3 方法
• 3.1 原核启动子Ptrc序列的设计
• 3.2 生长抑素原核真核双表达质粒的构建
• 4 结果与分析
• 4.1 启动子Ptrc检测
• 4.2 含Ptrc的PCR产物检测与回收
• 4.3 质粒χ6097（pPtrc-S/2SS-M4GFP-asd）鉴定
• 4.4 质粒C500（pPtrc-S/2SS-M4GFP-asd）鉴定
• 5 讨论
• 5.1 原核启动子结构为原核真核双表达提供理论基础
• 5.2 以减毒猪霍乱沙门氏菌为载体构建生长抑素原核真核双表达质粒
• 5.3 正确筛选质粒C500（pPtrc-S/2SS-M4GFP-asd）为评估其免疫效力奠定基础
• 第三章 生长抑素原核真核双表达质粒的表达与鉴定
• 1 前言
• 2 材料
• 2.1 质粒、菌株与细胞
• 2.2 工具酶及试剂
• 2.3 仪器设备
• 2.4 试剂的配制
• 3 方法
• 3.1 质粒pPtrc-S/2SS-M4GFP-asd的真核表达能力测定
• 3.2 原核蛋白表达能力测定
• 4 结果与分析
• 4.1 质粒pPtrc-S/2SS-M4GFP-asd在真核细胞中的表达
• 4.2 融合蛋白在沙门氏菌C500中的原核表达
• 5 讨论
• 5.1 pPtrc-S/2SS-M4GFP-asd质粒可实现真核表达
• 5.2 减毒猪霍乱沙门氏菌C500可原核表达SS融合蛋白
• 第四章 原核真核双表达生长抑素DNA免疫对小鼠生长及免疫应答的影响
• 1 前言
• 2 材料
• 2.1 质粒和菌株
• 2.2 实验动物
• 2.3 实验试剂及配制
• 3 方法
• 3.1 疫苗制备及其免疫方法
• 3.2 小鼠的饲养管理、周称重和周耗料量记录
• 3.3 小鼠血样的收集
• 3.4 生长抑素IgG抗体效价ELISA检测
• 3.5 生长抑素IgG1和IgG2α抗体分型效价检测
• 3.6 生长抑素（SS）检测
• 3.7 猪霍乱沙门氏菌C500（C500）抗体ELISA检测
• 3.8 数据分析
• 4 结果与分析
• 4.1 增重效果和饲料报酬
• 4.2 SSIgG、IgG1和IgG2α抗体水平
• 4.3 SS分泌水平
• 4.4 抗C500抗体水平检测
• 5 讨论
• 5.1 原核真核双表达质粒增强免疫应答、提高个体增重和饲料报酬
• 5.2 原核真核双表达基因疫苗倾向于Th2型免疫应答
• 5.3 减毒猪霍乱沙门氏菌C500促进免疫应答
• 全文总结
• 参考文献
• 致谢