氯霉素单克隆抗体的制备及其残留的电化学检测方法的研究

论文摘要

氯霉素（Chloramphenicol,CAP）曾作为广谱抗生素广泛应用于养殖业。但由于其具有严重的毒副作用,残留于动物性食品中的CAP严重威胁着人类健康,因此,欧美许多发达国家早已限制或严格禁止CAP应用于食品动物,并对动物性产品中CAP的最高残留限量制定了严格的标准。我国农业部于2002年12月明文规定CAP及其盐、酯等在所有食品动物的所有可食组织中不得检出。但由于其低廉的价格和稳定的抗菌性,在畜牧业及水产养殖业中违法使用CAP的现象仍屡见不鲜。到目前为止,国内外用于生物样品中CAP残留检测的方法和技术主要有色谱法、色谱-质谱联用法和免疫分析法等,但这些方法往往存在操作繁琐、分析速度慢、仪器复杂等不足。而生物传感器技术灵敏度高、检测快速方便,是今后研究和开发检测氯霉素等残留物的重要方法之一。为获得用于生物传感器研制的抗CAP单克隆抗体（Monoclonal antibody,McAb）,本试验采用混合酸酐法合成CAP的免疫全抗原琥珀酸氯霉素.牛血清白蛋白（Chloramphenicol Succinate-Bovine Serum Albumin,CAPS-BSA）及包被全抗原琥珀酸氯霉素-卵清蛋白（Chloramphenicol Succinate-Ovalbumin,CAPS-OVA）,并参照柴春彦等介绍的方法用紫外分光光度法鉴定了这两种抗原的结合比。试验结果表明,CAPS-BSA的结合比为33:1,CAPS-0VA的结合比为6:1。以CAPS-BSA为免疫原免疫巴贝斯（BALB/C）小鼠,经过细胞融合技术获得2株特异性分泌抗CAP抗体的细胞株,命名为20060723-1D11及20060723-4D2。因前者的效价及特异性均高于后者,所以选20060723-1D11分泌的抗体用于整个试验。用间接ELISA检测时该细胞株培养上清效价为1:200,诱生腹水抗体效价达1:12800。为探索用于现场检测牛乳中CAP残留的灵敏度高及特异性强的免疫传感器方法,本试验以CAPS-OVA为包被抗原并将其包被到聚苯乙烯反应板上;在孵育反应中,样品中的CAP与CAPS-OVA竞争结合抗CAP单克隆抗体,洗涤后加入碱性磷酸酶（ALP）标记的二抗,经再次孵育及洗涤后加入对硝基苯磷酸（pNPP）底物液;反应终止后用微分脉冲伏安（Differential Pulse Voltammetry,DPV）法记录pNPP的氧化峰电流,从而建立检测CAP的标准曲线。试验结果表明,pNPP被ALP催化水解的产物对硝基苯酚（PNP）可于1.20V（vs.Ag/AgCl）左右在玻碳电极上被氧化,该方法检测CAP的下限达到0.064μg/L,检测线性范围为0.15～600μg/L,测试牛奶样品的平均回收率达89.8%。另外,采用分子印迹技术和电化学聚合物法,在弱酸条件下,以琥珀氯霉素（CAPS）为模板分子,邻苯二胺（o-PD）为聚合单体,用循环伏安法合成了稳定的CAPS分子印迹膜,并用微分脉冲伏安法对此印迹膜进行了表征。结果表明,该膜响应快速、灵敏度高、选择性好、具有良好再生性能,在检测氯霉素电化学传感器的研制中具有良好的应用前景。本试验的创新之处在于在制备氯霉素单克隆抗体的基础上,将电化学传感器与固相酶联免疫分析技术相结合,建立快速、高效、准确的检测CAP残留的ALP-pNPP分析体系,从而为动物性食品中药物残留的检测提供有力的技术支持。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 缩略词表（Abbreviation）
• 1 前言
• 1.1 文献综述
• 1.1.1 氯霉素
• 1.1.2 氯霉素检测方法
• 1.1.3 生物传感器
• 1.2 研究的内容
• 1.2.1 抗氯霉素单克隆抗体的制备
• 1.2.2 检测氯霉素残留的电化学方法研究
• 1.3 研究的目的意义
• 2 抗氯霉素单克隆抗体的制备
• 2.1 材料与方法
• 2.1.1 试剂
• 2.1.2 氯霉素人工抗原的合成
• 2.1.3 氯霉素人工抗原的鉴定
• 2.1.4 氯霉素单克隆抗体细胞株的制备
• 2.1.5 氯霉素单克隆抗体的生产
• 2.1.6 氯霉素单克隆抗体的纯化
• 2.1.7 氯霉素50%抑制浓度的测定
• 2.1.8 氯霉素单克隆抗体特异性的鉴定
• 2.2 结果与分析
• 2.2.1 偶联物的鉴定
• 2.2.2 免疫小鼠血清效价ELISA分析结果
• 2.2.3 单克隆抗体细胞株的制备结果
• 2.3 讨论
• 2.3.1 抗原合成应注意问题
• 2.3.2 ELISA的筛选方法探讨
• 2.3.3 影响细胞融合的因素
• 2.3.4 杂交瘤细胞的选择性培养
• 2.3.5 杂交瘤细胞的检测和克隆
• 2.3.6 杂交瘤细胞的冻存和复苏
• 2.3.7 污染和控制
• 2.4 小结
• 3 基于对硝基苯磷酸-碱性磷酸酶体系的检测牛奶中氯霉素的免疫传感方法研究
• 3.1 材料与方法
• 3.1.1 试剂与仪器
• 3.1.2 方法
• 3.2 结果与分析
• 3.2.1 酶底物和酶催化产物的循环伏安曲线
• 3.2.2 对硝基苯酚在玻碳电极上的电化学行为
• 3.2.3 电化学条件确定
• 3.2.4 标准曲线的制作及最低检出限的确定
• 3.2.5 实际样品的检测与回收率确定
• 3.3 讨论
• 3.4 小结
• 4 氯霉素分子印迹膜的制备及其电化学特性
• 4.1 材料与方法
• 4.1.1 试剂与仪器
• 4.1.2 方法
• 4.2 结果与分析
• 4.2.1 分子印迹电聚合
• 4.2.2 分子印迹膜的表征
• 4.2.3 分子印迹效应
• 4.2.4 分子印迹膜的应用
• 4.2.5 分子印记膜的稳定性
• 4.3 讨论
• 4.3.1 模板分子的选择
• 4.3.2 分子印迹膜的结构形式探讨
• 4.3.3 分子印迹膜的稳定性
• 4.4 小结
• 参考文献
• 致谢
• 附录