转化稀有人参皂苷菌株的筛选、鉴定及转化条件优化

论文摘要

人参是五加科植物人参的根,作为药用植物早已被孰知。它作为传统药物在中国,日本、韩国已经沿用数千年。它的化学特性和药理活性早已被世界所关注。例如：抗衰老、抗炎、抗氧化等。人参皂苷是人参中主要的药理活性成分。目前已有40于种人参皂苷从人参根中被分离,主要包含人参皂苷Rb1、Rb2、Rc、Rg1和Re,它们占据所有人参皂苷的90%以上。近些年来含量少的稀有人参皂苷的活性被许多人关注。它们的获得也同时引起了人们的注意。本文的主要目的是从通化朝阳林场人参生长的土壤中筛选出能够转化生成稀有人参皂苷的菌株,并对影响菌株转化活力的条件进行研究探讨,期待能够筛选出高转化活力的菌株,这对人参的合理利用具有一定的意义,希望能为医药事业研究作出贡献。首先,利用乙醇蒸馏法从人参中分离提取人参总皂苷,再经过柱层析分离法获得二醇型人参皂苷混合物。其中包含Rb1、Rb2、Rc、Rd。以此作为转化底物。其次,从土壤中筛选出了92株菌,初筛结果表明有4株真菌能够将人参皂苷Rb1转化为人参皂苷Rd。其中以TH-10活性最高,转化作用最强。利用高效液相色谱法定性、定量分析了二醇型皂苷及其产物。最终建立了最为适宜的色谱条件：色谱柱：Ascentis Express C18柱（5cm×3.0mm,2.7μm）;流动相水（A）：乙腈（B）,梯度洗脱；柱温：35℃；检测波长：203nm；流速：1.0ml/min;进样量5μl。再次,通过对TH-10培养及显微特征观察,并结合分子生物学方法进行鉴定,鉴定结果为：TH-10属于曲霉属（Aspergillus）最后,为了进一步提高产率,本文研究了转化条件的初步优化,最佳结果为：投加底物时间为菌株培养后48小时,pH为5,温度为27℃,转化时底物的终浓度为0.15mg/ml。通过单因素实验结果对菌株的最高转化率进行了研究,结果表明该菌株对人参皂苷的最高转化率为73.77%

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 第一章 绪论
• 1.1 人参皂苷的研究概述
• 1.2 人参皂苷药理活性研究
• 1.3 人参皂苷的提取分离方法
• 1.4 人参皂苷的生物转化
• 1.4.1 酶转化
• 1.4.2 微生物转化
• 1.5 论文研究的目的、意义和内容
• 第二章 底物的制备
• 引言
• 2.1 试验材料
• 2.1.1 试剂
• 2.1.2 药品
• 2.1.3 设备与仪器
• 2.2 实验方法
• 2.2.1 硅胶柱层析法分离人参二醇组皂苷
• 2.2.2 HPLC法检测分离二醇型皂苷
• 2.3 结果与讨论
• 2.3.1 线性关系与线性范围考察
• 2.3.2 精密度试验
• 2.3.3 重现性试验
• 2.3.4 稳定性试验
• 2.3.5 加样回收率试验
• 2.3.6 一段皂苷成分测定结果
• 2.4 小结
• 第三章 转化人参皂苷菌株的筛选
• 引言
• 3.1 实验材料和仪器
• 3.1.1 实验材料
• 3.1.2 实验仪器
• 3.2 试验方法
• 3.2.1 用于微生物转化的培养基及其制备
• 3.2.2 转化人参皂苷菌株的筛选
• 3.2.3 溶液的配置及转化产物的检测
• 3.3 结果与讨论
• 3.4 小结
• 第四章 人参皂苷转化菌株TH-10的分类鉴定
• 引言
• 4.1 实验材料与仪器
• 4.1.1 主要试剂
• 4.1.2 实验仪器
• 4.1.3 菌株TH-10筛选于通化朝阳林场人参生长土壤
• 4.2 TH-10菌株鉴定方法
• 4.2.1 菌株形态学特征的观察
• 4.2.2 菌株培养特征的观察
• 4.2.3 菌株分子生物学鉴定
• 4.3 TH-10菌株鉴定结果
• 4.3.1 TH-10菌株的形态和培养特征
• 4.3.2 TH-10菌株的分子生物学鉴定
• 4.4 小结
• 第五章 菌株TH-10转化条件的优化
• 引言
• 5.1 实验材料与仪器
• 5.1.1 主要试剂
• 5.1.2 实验仪器
• 5.1.3 菌株
• 5.1.4 培养基
• 5.2 培养及分析方法
• 5.2.1 菌种的培养
• 5.2.2 菌种孢子悬液的制备
• 5.2.3 转化培养
• 5.2.4 样品检测
• 5.3 TH-10菌株转化条件的研究
• 5.3.1 最佳投加底物时间的选择
• 5.3.2 最佳pH的选择
• 5.3.3 最佳温度的选择
• 5.3.4 最佳底物浓度的选择
• 5.4 结果与讨论
• 5.4.1 最佳投料时间的选择
• 5.4.2 最佳pH的选择
• 5.4.3 最佳温度的选择
• 5.4.4 最佳底物浓度的选择
• 5.4.5 最高转化率
• 5.5 小结
• 总结
• 参考文献
• 致谢
• 作者简介
• 附件