论文摘要
鳖甲为鳖科动物（Trionyx sinensis W iegmann）的背甲,是临床常用动物药材之一,别名甲鱼,醋甲鱼。醋鳖甲,是采用砂烫醋淬的方法得到的生鳖甲炮制品。“十五”期间,中药鳖甲等50种中药饮片的炮制,被列为国家重点攻关项目,以期通过系统研究,利用现代医学理论和科技手段对中药炮制理论和方法进行去粗取精、去伪存真,达到改革完善中药炮制方法之目的。本课题组研究人员基于此对鳖甲化学成分、炮制工艺及质量标准,开展了一系列研究工作。工作中进一步研究证实,鳖甲中还含有寡肽类成分,并对醋鳖甲粉末水提液中的寡肽进行了分离、纯化与结构鉴定,得到了一个七肽化合物。为了获得更多的活性寡肽类化合物,我们对醋鳖甲的水提醇沉物做了深入研究,内容包括:醋鳖甲活性成分的筛选研究,活性部位的分离纯化研究,并探讨了结构修饰应用于醋鳖甲活性寡肽分离纯化的方法.主要开展了以下研究工作:一、文献综述1综合评价分析了醋鳖甲的化学成分、药理作用及临床应用等研究情况,着重探讨了醋鳖甲的化学成分及应用。为后期制定切实可行的研究方案、确定研究考察指标及研究工作起点奠定了坚实的基础,共引用文献17篇。2对寡肽类化合物的药理研究进展,分离纯化及一级结构测定进行了综述,为后期活性寡肽分离纯化及结构鉴定提供了很好的参考依据,共引用文献51篇。3综述了鸡胚绒毛尿囊膜（CAM）模型在药物抑制血管生成研究中的应用,对药物置入时间的选择、CAM内微血管变化的定量研究进行了介绍。未来CAM血管生成的研究将会把重心集中在寻找抑制CAM血管生成的方法,用以控制肿瘤的生长与转移,共引用文献24篇。二、实验研究1课题组前期研究,采用大孔吸附树脂-HPLC联用法,分离并鉴定了醋鳖甲中的1个化合物AAHGPCG,该化合物为首次从自然界分离得到的。2应用鸡胚绒毛尿囊膜（CAM）模型,对醋鳖甲粉末水提浓缩干膏、20%醇沉、40%醇沉、60%醇沉、80%醇沉及95%醇沉六个部位进行了活性筛选研究。结果提示:醋鳖甲粉末六个提取部位都具有抑制血管生成作用（p<0.05）,尤其80%醇沉活性最强;对80%醇沉sephedaxLH-20洗脱得到的三个肽类部位做了进一步活性筛选,结果提示:三部位都具有抑制血管生成作用（p<0.05）,尤其F2活性最强;对三个肽类部位分别纯化得到的三份样品,鸡胚活性试验提示三个肽类部位均具有抑制血管生成作用（p<0.05）,其中F3-22活性最强。3我们采用凝胶色谱法（Sephadex LH-20） ,结合双缩脲试剂跟踪,主要对80%醇沉部位中的F2与F3活性较强部位进行分离纯化。F2水液丙酮沉淀纯化后,上C18反相柱反复纯化。其中F2-20%甲醇洗脱部分中的F2-105号量多且呈白色固形物。F3水液丙酮沉淀纯化后, C18反相柱纯化,双缩脲显色跟踪,分为5个部分,其中20%甲醇洗脱部分中的F3-22号量多且呈白色固形物。三份纯品F1-107,F2-105,F3-22的色谱图与空白对照,可以明显看出F2-105号样品纯度最高。我们对F2-105号做了1H-NMR谱、13CNMR谱、H-H COSY、QC和BC谱,然后通过氨基酸测序,得到其一级结构为:G/A--E/P--A/G—G--A/P--Q/I—G。4采用DNS-Cl结构修饰法,使肽类成分衍生化后极性降低,同时能够引入荧光基团。建立聚酰胺层析和聚酰胺薄层方法,分离肽衍生物得到四部分白色固状物Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ和Ⅳ,其中Ⅲ部分经聚酰胺反复纯化得白色固状物Ⅲ-1和Ⅲ-2。Ⅳ经结构鉴定为DNS-OH;结果提示我们未和肽衍生的Ⅳ与已经衍生的肽Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ能很好分离开,且Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ在聚酰胺薄层上可观察到明显黄色肽的荧光点,经液相也得到很好分离。故聚酰胺层析能初步成功地应用于醋鳖甲提取物中粗肽衍生物的分离纯化,所建立的方法易于操作,重现性好,聚酰胺再生后能够重新使用,消耗少,是一种纯化肽衍生物的好方法。