ETEC肠毒素SYBR Green Ⅰ荧光定量PCR检测方法的建立

论文摘要

仔猪腹泻是影响养猪业健康发展的主要疾病之一。尽管导致仔猪发生腹泻的原因非常复杂,但产肠毒性大肠埃希菌（Enterotoxigenic E.coli,ETEC）是引起仔猪腹泻的主要病原菌。目前,国内外很多学者对由ETEC引起腹泻的发病机理、诊断和防治进行了大量的研究并取得了很大的进展,但对猪源ETEC在机体肠道内分子水平的增殖研究较为有限。本研究基于SYBR GreenⅠ染料建立检测LT和STa两种肠毒素基因的荧光定量PCR方法,旨在特异、快速地检测猪源ETEC。此外,本研究还通过该法对猪源ETEC在人工感染小鼠肠道内的增殖规律进行研究,为进一步阐明ETEC在体内的致病机制提供实验数据。结果如下:1.常规PCR扩增LT基因的部分序列,获得314 bp的目的片段,对该核酸序列进行克隆,重组质粒经PCR及测序鉴定后,根据测序结果设计一对荧光定量引物,将梯度稀释的重组质粒pMD19-LT作为标准品,建立LT的SYBR GreenⅠ实时荧光定量PCR标准曲线为:Y=-3.33X+42.77,相关系数为0.999,PCR扩增效率为99.7%,其灵敏度为4.09×103拷贝/μL,特异性试验结果显示大肠埃希菌C83912（STa+）和ATCC25922为阴性,而C83903（LT+）和重组质粒pMD19-LT为阳性,说明设计的引物对LT具有特异性。重复性试验结果显示批内和批间重复性试验的变异系数均小于3%,说明该方法具有良好的稳定性和重复性。2.根据GeneBank中公布的STa序列（登录号为M25607）,选择在其保守区设计引物,PCR可获得323bp的目的片段,对该核酸序列进行克隆,重组质粒经PCR及测序鉴定后,根据测序结果设计一对荧光引物,将梯度稀释的重组质粒pMD19-STa作为标准品,建立STa的SYBR GreenⅠ实时荧光定量PCR标准曲线为:Y=-3.271X+47.902,相关系数为0.999,PCR循环效率为102.2%,其灵敏度达到8.85×102拷贝/μL,特异性试验结果显示大肠埃希菌C83903 （LT+）和ATCC25922为阴性,而C83912（STa+）和重组质粒pMD19-STa为阳性,说明STa引物只能扩增STa基因片段。重复性试验结果显示批内变异系数分别为1.08%,0.92%,0.61%,批间变异系数分别为1.22%,1.86%,1.51%,表明该方法具有良好的准确性和重复性。3.用大肠埃希菌C83903 （LT+）和C83912（STa+）感染小鼠建立腹泻模型,收集小肠内容物,利用上述建立的荧光定量方法对其进行检测。检测结果显示:人工感染致病性ETEC（LT+）的小鼠在感染后第4 h、16 h和2 d样品均为阳性,第7 d和第14 d样品为阴性。人工感染致病性ETEC（STa+）的小鼠自感染后第4 h、16 h、2 d、7 d、14 d的样品均为阳性。以上结果表明,肠毒素LT和STa在感染机体肠道组织的增殖存在差异,本研究从分子水平对致仔猪腹泻ETEC的感染致病机制提供进一步的认识。

论文目录

• 摘要
• ABSTRACT
• 文献综述
• 第一章 肠毒素性大肠埃希菌肠毒素研究进展
• 1.1 不耐热肠毒素（Heat-labile toxin，LT）
• 1.1.1 LT 的理化性质和分类
• 1.1.2 LT 的分子结构和生物学功能
• 1.1.3 LT 的致病机理
• 1.2 耐热性肠毒素（Heat-stable toxin，ST）
• 1.2.1 ST 的理化性质和分类
• 1.2.2 ST 的分子结构和生物学功能
• 1.2.3 STa 的致病机理
• 1.3 肠毒素的检测
• 第二章 实时荧光定量PCR 法研究进展
• 2.1 实时荧光定量PCR 技术的原理
• 2.2 实时荧光定量PCR 方法的分类
• 2.2.1 非特异性DNA 结合染料法
• 2.2.2 探针法
• 2.3 荧光定量PCR 技术的应用
• 2.3.1 病原体的分子检测
• 2.3.2 基因表达的定量分析
• 2.3.3 单核苷酸多态性分析
• 2.3.4 实时荧光定量PCR 技术的应用前景
• 试验研究
• 第三章 SYBR GreenⅠ荧光定量PCR 检测ETEC 肠毒素方法的建立
• 3.1 材料
• 3.1.1 试验菌株
• 3.1.2 主要试剂
• 3.1.3 主要仪器与设备
• 3.2 方法
• 3.2.1 PCR 引物的设计与合成
• 3.2.2 细菌基因组DNA 的提取
• 3.2.3 常规PCR 扩增
• 3.2.4 PCR 产物的胶回收
• 3.2.5 胶回收产物与Pmd 19-T Vector 连接
• 2 法）'>3.2.6 感受态细胞的制备（CaCl₂法）
• 3.2.7 连接产物的转化
• 3.2.8 菌液PCR 鉴定
• 3.2.9 重组质粒的提取
• 3.2.10 重组质粒PCR 鉴定
• 3.2.11 重组质粒的拷贝数计算
• 3.2.12 SYBR GreenⅠ荧光定量PCR 方法的建立
• 3.3 结果
• 3.3.1 肠毒素基因PCR 产物的鉴定、测序结果
• 3.3.2 DNA 标准品纯度测定
• 3.3.3 SYBR GreenⅠ荧光定量PCR 标准曲线的制作及线性范围分析
• 3.3.4 SYBR GreenⅠ荧光定量PCR 反应的特异性分析
• 3.3.5 SYBR GreenⅠ荧光定量PCR 反应的准确性和重复性
• 3.4 讨论
• 3.4.1 检测ETEC 的Q-PCR 方法的建立
• 3.4.2 荧光定量PCR 标准品的选择
• 3.5 小结
• 第四章 SYBR GreenⅠ荧光定量PCR 检测小鼠肠道内容物中的ETEC
• 4.1 材料
• 4.1.1 试验菌株
• 4.1.2 试验动物
• 4.1.3 主要试剂
• 4.1.4 主要仪器
• 4.2 方法
• 4.2.1 细菌计数
• 4.2.2 接种方案
• 4.2.3 采样方案
• 4.2.4 样品处理
• 4.2.5 样品的定量检测
• 4.3 结果
• 4.3.1 临床表现及病变
• 4.3.2 人工感染小鼠肠道内容物中LT 和STa 的ETEC 的增殖情况
• 4.4 讨论
• 4.4.1 含LT 的ETEC 感染与宿主细胞的关系
• 4.4.2 含STa 的ETEC 感染与宿主细胞的关系
• 4.5 小结
• 结论
• 参考文献
• 附录
• 缩略词
• 致谢
• 作者简介