烟草疫霉菌效应物基因比较基因组学分析

论文摘要

疫霉菌(Phytophthora)是一类危害极大的植物病原菌,在全球范围内常造成农作物和观赏植物生产的严重损失。烟草疫霉菌(P.nicatianae),又称寄生疫霉菌,其寄主范围很广,除了引起烟草黑胫病,还可以侵染上千种植物,每年造成巨大的经济损失。由于疫霉菌的极度多样性,从分子水平研究寄生疫霉菌的致病机理,将有助于全面认识疫霉菌的病原生物学,为病害的防治提供理论依据,对作物病害的控制和农业的可持续发展有着重要意义。本研究是在大豆疫霉菌无毒基因Avr1b和致病疫霉无毒基因Avr3a成功定位克隆的基础上,依据比较基因组学所揭示的相近物种之间染色体上基因分布存在的线性关系,在寄生疫霉菌基因组中构建相应区域的物理图谱。在大豆疫霉菌无毒基因Avr1b和致病疫霉无毒基因Avr3a两侧寻找保守序列,并以此序列为探针筛选寄生疫霉菌的大片段基因组文库(BAC文库),将得到的阳性BACs进行酶切,和比较分析,最终在Avr1b和Avr3a的相应位点构建了两个约160kb,可能涵盖无毒基因的寄生疫霉区域物理图谱。部分BACs末端测序结果初步表明,在Avr1b和Avr3a区域,寄生疫霉菌分别与大豆疫霉菌和致病疫霉呈现一定的线性关系。为寄生疫霉菌无毒基因的比较基因组学鉴定奠定了基础。同时,本研究还以寄生疫霉菌染病组织的总RNA为模板,合成cDNA探针,筛选得到的两个160kb的寄生疫霉菌基因组区域,获得数个阳性信号,并对其中的部分阳性信号的条带进行亚克隆并测序。测序结果经过核酸序列分析比对后得知大部分亚克隆与Hyaloperonospora parasitica的序列有同源关系,而在P.sojae和P.infenstans上只有少数的序列有同源关系,而对于其本身所编码的蛋白功能未知,还需要进一步的研究验证。

论文目录

• 摘要
• ABSTRACT
• 第一章 文献综述
• 1.1 引言
• 1.2 烟草疫霉菌病原学研究
• 1.2.1 分类地位
• 1.2.2 致病性与生理分化的发现与机制
• 1.2.3 病原菌的生理特性及寄主范围
• 1.3 本研究的基础
• 1.3.1 疫霉菌与寄主的互作研究
• 1.3.2 疫霉菌的功能基因组学研究
• 1.3.3 烟草疫霉菌的分子遗传操作
• 1.3.4 比较基因组学研究
• 1.3.5 无毒基因的研究进展
• 第二章 特定区域物理图谱的构建
• 2.1 供试材料与方法
• 2.1.1 供试菌种
• 2.1.2 烟草疫霉菌基因组文库
• 2.1.3 试剂
• 2.1.4 实验中培养基的制备
• 2.1.5 方法
• 2.1.6 烟草疫霉菌（H1111）和大豆疫霉菌（R2）基因组DNA的提取
• 2.1.7 保守区域的确定及探针模板的制备
• 2.1.8 Southern杂交尼龙膜的制备
• 2.1.9 斑点杂交尼龙膜的制备
• 2.1.10 Southern杂交—BAC文库的筛选
• 2.1.11 斑点杂交的原理及步骤
• 2.1.12 烟草疫霉菌特定区域物理图谱的构建
• 2.1.13 对所选BACs进行末端测序
• 2.2 结果与分析
• 2.2.1 疫霉菌基因组DNA的提取
• 2.2.2 Southern杂交和斑点杂交探针模板的制备
• 2.2.3 Southren杂交结果
• 2.2.4 斑点杂交结果
• 2.2.5 特定区域物理图普的构建
• 2.2.6 BACs质粒末端测序分析
• 2.3 讨论
• 第三章 特定区域内烟草疫霉菌侵染期转录基因的筛选
• 3.1 材料与方法
• 3.1.1 BACs质粒的酶切
• 3.1.2 对BACs的基因扫描
• 3.1.3 BACs阳性信号的亚克隆及分析
• 3.2 结果与分析
• 3.2.1 感染H1111烟草组织RNA的提取
• 3.2.2 以cDNA为探针的Southern杂交
• 3.2.3 阳性条带的亚克隆及分析
• 3.3 讨论
• 第四章 结论
• 参考文献
• 附录
• 致谢
• 作者简介