盐沼盐杆菌bop基因及启动子的克隆及BR蛋白突变体的构建和光致变色功能的研究

论文摘要

本研究通过重组PCR方法,从盐沼盐杆菌（Halobactrium salinarium）S9基因组上扩增了编码细菌视紫红质（bacteriorhodopsin,BR）蛋白的bop基因及启动子部分。测序结果表明,与NCBI数据库中的bop基因及启动子的序列完全相同,且其表达产物的分子量与野生型BR蛋白的分子量一致,并且在568nm处表现出BR蛋白的特征吸收峰。采用基因定点突变的方法,构建了三个突变体,即单突变bopG649C,三突变bopT395C/A400T/G415C和四突变bopG649C/T395C/A400T/G415C。将突变基因以及野生型的基因分别连接到表达载体pXLNovR上,在宿主菌株L33（bop-）中进行了表达。突变基因表达的BR突变体分别为BRE204Q,BRI119T/T121S/A126T,BR(E204Q/I119T/T121S/A126T。经过紫外可见光谱的测定,单突变BRE204Q在552和570nm之间有个比较宽的吸收峰,三突变BRI119T/T121S/A126T在555nm和572nm之间有一个比较宽的吸收峰,四突变体BRE204Q/I119T/T121S/A126T在410nm和552nm都有一个吸收峰。通过对其M412闪光动力学的研究表明,单突变体BRE204Q的M态的寿命为7.10ms,三突变体BRI119T/T121S/A126TM态的寿命为8.23ms,四突变体BRE204Q/I119T/T121S/A126TM态的寿命为19.85ms,均较野生型的BR蛋白M态的寿命（6.23ms）有所延长,且四突变体表现的最为显著,其M态寿命比野生型BR蛋白增加了218.6%。对突变体质子泵功能的检测发现,突变体的质子泵功能也有所改变,其中单突变体BRE204Q和三突变体

论文目录

• 中文摘要
• 英文摘要
• 引言
• 1、嗜盐古生菌
• 2. BR蛋白
• 2.1 BR蛋白的结构和功能
• 2.2 BR蛋白的光循环
• 2.3 BR蛋白的质子传递机理
• 2.4 BR蛋白的光致变色和光致异构化量子效率
• 2.5 BR分子的应用
• 2.6 bop基因的表达调控
• 2.7 BR蛋白的表达系统
• 2.8 有关BR分子结构和功能方面的研究概况
• 2.9 本课题的研究目的和意义
• 3、实验材料
• 3.1 菌株
• 3.2 基因和载体
• 3.3 主要工具酶和试剂
• 3.4 培养基
• 3.5 主要溶液
• 4、实验方法
• 4.1 bop基因的克隆
• 4.2 bop基因的定点突变
• 4.3 表达质粒的构建
• 4.4 嗜盐菌的转化
• 4.5 紫膜的提取
• 4.6 BR蛋白紫外-可见光谱测定
• 412态闪光动力学的测定'>4.7 BR蛋白M₄12态闪光动力学的测定
• 4.8 BR蛋白质子泵功能的检测
• 5、试验结果
• 5.1 bop基因及启动子的克隆和序列分析
• 5.2 bop基因的定点突变与鉴定
• 5.3 表达产物的鉴定
• 5.4 BR蛋白的紫外-可见吸收光谱
• 412中间态的闪光动力学光谱'>5.5 BR蛋白M₄12中间态的闪光动力学光谱
• 5.6 BR蛋白质子泵功能的检测
• 6、讨论
• 6.1 bop基因及启动子的克隆
• 6.2 bop基因的突变和表达
• 6.3 BR蛋白突变体结构变化
• 412中间态的闪光动力学'>6.4 BR蛋白M₄12中间态的闪光动力学
• 6.5 BR蛋白的质子泵功能
• 6.6 小结
• 参考文献
• 研究生期间发表和待发表论文和申报的发明专利
• 致谢