河南省乙型脑炎病毒的分离鉴定及分子特性分析

论文摘要

乙型脑炎（Japanese B encephalitis）是由黄病毒科的乙型脑炎病毒引起的以蚊虫为媒介传播的一种人畜共患病毒性传染病,主要导致人的中枢神经系统疾病和母猪繁殖障碍,该病不但影响畜牧业尤其是养猪业的发展,而且严重威胁人类健康,已成为严重的公共卫生问题。我国是乙型脑炎发病病人最多的国家,占全球病例总数80%左右。猪是乙型脑炎最重要的自然增殖动物和主要传染源,蚊虫是传播媒介,猪→蚊→猪的传播模式导致病毒得到广泛传播和大量增殖,猪→蚊→人的传播方式导致人的感染和发病。因此,猪乙型脑炎的有效防制对养猪业的发展和人类健康均具有重要的公共卫生学意义。参考GenBank中（M55506.1）JEV SA14-14-2序列设计一对针对JEV PrM-C区的特异性引物,以JEV疫苗株为模板,建立检测JEV的RT-PCR方法。应用该方法对JEV疫苗株RNA进行扩增,获得与预期相符的大小为495bp的目的片段;检出JEV RNA的最低检出量为10pg。应用该方法对采集的136份蚊虫标本进行JEV检测,结果检测到6份为阳性。结果表明,该方法可以用于JEV的快速检测。为了了解河南省JEV的生态学分布,在2009年7-9月和2010年7-9月期间,对河南省驻马店、周口、信阳等7个地区的55个猪舍采集蚊虫标本136份,通过乳鼠接种和Vero细胞接种传代,进行JEV的分离。通过RT-PCR检测、病毒感染力（TCID50）的滴定和琼扩试验等鉴定,证实分离到5株JEV,分别命名为HN10-1株、HN10-2株、Shilipu株、Guangshan株和Luoshan株。应用RT-PCR扩增分离株的PrM基因,对其进行克隆测序及进化分析,结果表明:分离到的HN10-1株为JEV基因Ⅰ型,其余四株JEV均属于基因Ⅲ型。同时对Guangshan和Luoshan两分离株的E基因进行克隆测序及进化分析,结果表明:Guangshan和Luoshan两分离株的PrM基因的核苷酸同源性为99.0%,氨基酸同源性为97.4%;E基因核苷酸同源性为99.7%,氨基酸同源性99.5%。Guangshan分离株与与疫苗株SA14-14-2的PrM基因的核苷酸同源性达到99.7%,氨基酸同源性为96.6%;Luoshan分离株与疫苗株SA14-14-2的PrM基因的核苷酸同源性为98.7%,氨基酸同源性为99.1%。而Guangshan分离株与疫苗株SA14-14-2的E基因核苷酸同源性为99.3%,氨基酸同源性为98.7%; Luoshan分离株与疫苗株SA14-14-2的E基因核苷酸同源性为99.4%,氨基酸同源性为98.9%。与疫苗株SA14-14-2的PrM蛋白氨基酸相比较,Luoshan分离株存在3个氨基酸差异,分别位于M25（D→G）、M66（G→S）、M67（N→T）、M79（Q→R）;Guangshan分离株存在1个氨基酸差异,位于M67（N→T）。与疫苗株SA14-14-2的E蛋白氨基酸相比较,Luoshan株存在3个氨基酸差异,分别位于E218（F→I）、E331（S→C）、E390（R→M）;Guangshan株存在5个氨基酸差异,分别位于E23（L→W）、E44（M→K）、E218（F→I）、E331（S→C）、E390（R→M）,两分离株E138和E176位氨基酸与疫苗株SA14-14-2没有差异,而HN10-1株、HN10-2株、Shilipu株的E基因特征还有待于进一步研究。

论文目录

• 致谢
• 中文摘要
• 文献综述
• 1 乙型脑炎病毒简介
• 2 乙型脑炎病毒的病原学特性
• 3.乙型脑炎病毒基因组结构
• 4 乙型脑炎病毒的基因分型及分布状况
• 5.乙型脑炎病毒的诊断方法
• 6.乙型脑炎的防治
• 实验一 乙型脑炎病毒RT-PCR 检测方法的建立及初步应用
• 引言
• 1 材料与方法
• 2 结果
• 3. 讨论
• 实验二 河南省猪舍蚊虫中乙型脑炎病毒的分离及鉴定
• 引言
• 1、材料与方法
• 2、结果
• 3、讨论
• 实验三 乙型脑炎病毒河南分离株PrM/E 基因的克隆、测序及分析
• 引言
• 1 材料与方法
• 2 结果
• 3 讨论
• 参考文献
• Abstract
• 附录