重组马白细胞介素-18的鉴定及其定量抗原捕获ELISA检测方法的建立

论文摘要

白细胞介素-18（IL-18）是一种重要的细胞因子,它能作用于I型辅助性T细胞（Th1）,并在IL-12的协同作用下能强烈诱导其产生IFN-γ。近来研究表明:IL-18具有广泛的生物学活性,在介导细胞免疫、抵抗微生物感染和抗肿瘤方面起着重要的作用。因此,IL-18在临床上可作为免疫增强剂、抗微生物或抗肿瘤制剂得以应用。到目前为止,国内外已有人、小鼠、猴、猪、牛和羊等种属的IL-18商品化制剂及其相应的单克隆抗体（McAb）或多克隆抗体（PcAb）以及夹心ELISA试剂盒的商品化供应。然而,有关马IL-18（EIL-18）的研究较少且相对滞后,迄今为止,还未见有可供商品化的EIL-18和抗EIL-18 McAb或PcAb及其夹心ELISA试剂盒等相关产品。本研究采用RT-PCR从经ConA刺激的马外周血单核细胞（PBMCs）中扩增获得编码EIL-18前体蛋白（precursor EIL-18,pEIL-18）的DNA,然后克隆至载体pMD18-T中,鉴定正确的重组质粒命名为pMD-EIL-18。自pMD-EIL-18中分别扩增pEIL-18及其成熟蛋白（mature EIL-18,mEIL-18）基因,并将其亚克隆至原核表达载体pET-28a（+）和pET-26b（+）中,重组质粒鉴定正确后命名为pET-pEIL-18、pET-EIL-18和pET-mEIL-18。然后分别转化至大肠杆菌感受态BL21（DE3）中进行诱导表达,表达产物经SDS-PAGE分析,结果表明所得到重组蛋白分别约为25kD、20kD和18kD,经Western-blot鉴定结果表明这3种重组蛋白均能与兔抗人IL-18发生免疫学反应,将这3种表达的重组蛋白分别命名为rpEIL-18、rEIL-18和rmEIL-18。在此基础上,本研究建立了rpEIL-18、rEIL-18和rmEIL-18在非变性状态下通过镍柱亲和层析或偶联了抗EIL-18 McAb的CNBr-activated Sepharose 4B亲和层析纯化重组蛋白的方法,采用该方法纯化获得了高纯度的重组蛋白rpEIL-18、rEIL-18和rmEIL-18。为鉴定所获得的重组蛋白rpEIL-18、rEIL-18和rmEIL-18是否具有生物学活性,本研究还建立了一种检测马IFN-γmRNA拷贝数的实时荧光定量RT-PCR方法,并采用本方法评价了rpEIL-18、rEIL-18和rmEIL-18在重组人白细胞介素-12（rhIL-12）协同下在体外刺激马PBMCs所产生IFN-γ的状况。结果表明,rpEIL-18不具有相应的生物学活性,而rEIL-18和rmEIL-18具有类似天然EIL-18生物学活性的特性。利用上述纯化后的rEIL-18抗原免疫新西兰白兔,制备了高效价的抗EIL-18 PcAb。同时,采用相同抗原免疫BALB/c小鼠,取脾细胞与SP2/0骨髓瘤细胞进行融合,以昆虫/杆状病毒表达系统获得的重组mEIL-18（rAcEIL-18）作为检测抗原进行间接ELISA检测,共筛选获得9株能稳定分泌抗体的单细胞克隆株。利用Western-blot和IFA实验对9株单克隆抗体（McAbs）进行鉴定,结果显示,所获得的9株细胞分泌的抗体均能与rEIL-18和rAcEIL-18发生特异性反应。将此9株McAbs分别与用原核系统分段表达的重组马白细胞介素-18成熟蛋白mEIL-181-78和mEIL-1879-157进行特异性ELISA检测,结果表明,其中5株能识别所表达的mEIL-181-78,而另外4株能与mEIL-1879-157发生反应,说明所获得的9株McAbs至少能针对rmEIL-18 2个或2个以上不同的抗原表位。采用单克隆抗体亚型鉴定试剂盒对该9株McAbs进行亚型鉴定,结果表明,除M1F11、M3A11和N7D9为IgM,其余的McAbs均为IgG1,而且所有McAbs的轻链均为κ链。将9株McAbs分别与rEIL-18和rmEIL-18进行中和活性测定,结果表明S1D7株对有生物活性的rEIL-18和rmEIL-18均具有中和效应。将抗EIL-18的McAbs和PcAb进行粗提和亲和层析纯化,并对纯化后S6A3和B1G1株McAbs和PcAb进行生物素标记。通过对各株McAb或PcAb分别作为捕获抗体或检测抗体进行初步的配对筛选后,以亲和纯化的S6A3株McAb作为捕获抗体,生物素标记的B1G1株McAb作为检测抗体,经方阵试验优化抗原捕获ELISA反应体系,以不同浓度梯度的rEIL-18为捕获抗原进行ELISA检测绘制其OD值-抗原浓度标准曲线,确定检测灵敏度为15pg/mL。采用所建立的抗原捕获ELISA检测方法对健康和EIAV感染的马血清及猪、牛、羊血清进行检测,结果表明,猪血清、牛血清和羊血清在该检测方法中均无发生交叉反应性,健康马血清中EIL-18的含量在40-80pg/mL之间,而EIAV感染后的马血清中EIL-18含量略微升高,在70-150pg/mL之间。由于各种属的IL-18存在一定的交叉反应性,为了检测本研究所获得抗EIL-18 McAbs是否能够用于检测其他种属IL-18并确定其检测极限,参照配对筛选结果和上述建立好的EIL-18定量抗原捕获ELISA检测方法,以S1C6株McAb作为捕获抗体,生物素化的抗EIL-18 PcAb为检测抗体,商品化的重组猪IL-18（rPIL-18）为捕获抗原绘制OD值-抗原浓度标准曲线,确定检测灵敏度为30pg/mL,建立了基于抗EIL-18抗体为检测和捕获抗体的猪IL-18（PIL-18）定量抗原捕获ELISA检测方法;以S5F1株McAb作为捕获抗体,生物素化的抗EIL-18 PcAb为检测抗体,初步建立了以抗EIL-18抗体为检测和捕获抗体的牛IL-18（BIL-18）定量抗原捕获ELISA检测方法。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 第一章 绪论
• 1.1 白细胞介素-18 简介
• 1.1.1 IL-18 结构及组织分布
• 1.1.2 IL-18 生物学特性
• 1.1.2.1 IL-18 在Th1 发育和γ-IFN 产生中的作用
• 1.1.2.2 IL-18 增强免疫细胞的细胞毒活性
• 1.1.2.3 IL-18 的促炎症反应特性
• 1.1.3 IL-18 在疾病中的角色
• 1.1.3.1 IL-18 在传染性疾病中的作用
• 1.1.3.2 IL-18 在肿瘤疾病中的作用
• 1.1.3.3 IL-18 在自身免疫性及炎症性疾病中的作用
• 1.1.4 IL-18 的应用性研究
• 1.2 马白细胞介素-18 研究现状
• 1.2.1 马IL-18 基因的克隆及其重组蛋白的表达
• 1.2.2 其它种属IL-18 基因的克隆及其重组蛋白的表达
• 1.2.3 抗马IL-18 McAb 及其检测方法
• 1.2.4 其它种属IL-18 McAb 及其检测方法
• 1.3 本研究的主要内容和意义
• 第二章 马白细胞介素-18 的基因克隆、构建、表达、纯化及生物学活性鉴定
• 2.1 材料
• 2.1.1 实验动物
• 2.1.2 质粒与菌种
• 2.1.3 主要试剂
• 2.1.4 主要溶液和培养基的配制
• 2.1.5 主要仪器
• 2.2 方法
• 2.2.1 引物的设计
• 2.2.2 马PBMCs 的分离及其总RNA 的提取
• 2.2.3 目的基因的扩增及其克隆
• 2.2.4 所扩增EIL-18 基因的进化分析
• 2.2.5 pET-pEIL-18、pET-EIL-18 和pET-mEIL-18 表达载体的亚克隆
• 2.2.6 pET-pEIL-18、pET-EIL-18 和pET-mEIL-18 在 E. coli 中的表达及条件的优化
• 2.2.7 目的蛋白的鉴定
• 2.2.8 目的蛋白rpEIL-18、rEIL-18 和rmEIL-18 的纯化
• 2.2.8.1 目的蛋白rpEIL-18 和rEIL-18 的纯化
• 2.2.8.2 抗EIL-18 单克隆抗体免疫亲和层析柱的制备
• 2.2.8.3 目的蛋白rmEIL-18 的纯化
• 2.2.9 目的蛋白rpEIL-18、rEIL-18 和rmEIL-18 浓度测定
• 2.2.10 rpEIL-18、rEIL-18 和rmEIL-18 生物活性的鉴定
• 2.2.10.1 检测马IFN- γ的引物与探针的设计
• 2.2.10.2 马IFN- γ基因的体外转录及其产物的纯化与定量
• 2.2.10.3 标准曲线的绘制
• 2.2.10.4 rpEIL-18、rEIL-18 和rmEIL-18 生物活性的检测
• 2.2.10.5 rEIL-18 和rmEIL-18 体外刺激能力呈一定的剂量依赖性确定
• 2.2.11 EIL-18 分子内或分子间二硫键的预测
• 2.3 结果
• 2.3.1 EIL-18 基因的克隆、序列测定及其分析
• 2.3.2 pET-pEIL-18、pET-EIL-18 和pET-mEIL-18 重组质粒的构建和鉴定
• 2.3.3 pET-pEIL-18、pET-EIL-18 和pET-pEIL-18 在 E. coli 中的表达及鉴定
• 2.3.4 表达条件的优化
• 2.3.5 rpEIL-18、rEIL-18 和rmEIL-18 蛋白的纯化及浓度测定
• 2.3.6 rpEIL-18、rEIL-18 和rmEIL-18 蛋白的生物活性鉴定
• 2.3.6.1 标准曲线的绘制
• 2.3.6.2 rpEIL-18、rEIL-18 和rm EIL-18 生物活性的检测
• 2.3.7 EIL-18 分子二硫键的预测
• 2.4 讨论
• 第三章 抗 EIL-18 多克隆抗体和单克隆抗体的制备与特性鉴定
• 3.1 材料
• 3.1.1 重组杆状病毒和细胞系
• 3.1.2 实验动物
• 3.1.3 主要试剂
• 3.1.4 主要溶液和培养基的配制
• 3.1.5 主要仪器
• 3.2 方法
• 3.2.1 免疫抗原和检测抗原的制备
• 3.2.2 间接ELISA 检测方法的建立
• 3.2.2.1 动物免疫及阳性血清与阴性血清的制备
• 3.2.2.2 抗原包被最佳浓度的确定
• 3.2.3 多克隆抗体的制备及效价确定
• 3.2.4 细胞融合
• 3.2.4.1 SP2/0 细胞的制备
• 3.2.4.2 饲养细胞的制备
• 3.2.4.3 脾细胞的制备
• 3.2.4.4 细胞融合
• 3.2.5 杂交瘤细胞的选择性培养及单克隆抗体的筛选检测
• 3.2.6 杂交瘤细胞的克隆化及冻存和复苏
• 3.2.6.1 克隆及扩增（有限稀释法）
• 3.2.6.2 细胞冻存
• 3.2.6.3 细胞复苏
• 3.2.7 单克隆抗体腹水的制备
• 3.2.8 杂交瘤细胞及单克隆抗体特性的鉴定
• 3.2.8.1 腹水效价的测定
• 3.2.8.2 Western-blotting 鉴定
• 3.2.8.3 间接免疫荧光分析
• 3.2.8.4 中和活性的测定
• 3.2.8.5 抗体亚类的测定
• 3.2.8.6 杂交瘤细胞株抗体分泌稳定性的测定
• 3.2.9 抗EIL-18 单克隆抗体的表位初步鉴定
• 3.2.9.1 马白细胞介素-18 成熟蛋白基因（mEIL-18）的分段表达
• 3.2.9.2 各株抗EIL-18 McAbs 表位的初步鉴定
• 3.2.10 抗EIL-18 单克隆抗体的相对亲和力的测定
• 3.3 结果
• 3.3.1 免疫抗原和检测抗原的制备
• 3.3.2 间接ELISA 检测方法的建立
• 3.3.3 多克隆抗体效价检测
• 3.3.4 杂交瘤细胞株的获得
• 3.3.5 抗EIL-18 杂交瘤细胞株腹水效价及抗体分泌稳定性的测定
• 3.3.6 单克隆抗体的Western-blot 鉴定
• 3.3.7 间接免疫荧光（IFA）检测
• 3.3.8 单克隆抗体的中和活性
• 3.3.9 单克隆抗体的亚型鉴定
• 3.3.10 抗EIL-18 单克隆抗体的表位初步鉴定
• 3.3.11 抗EIL-18 单克隆抗体的相对亲和力的测定
• 3.4 讨论
• 第四章 EIL-18 定量抗原捕获 ELISA 检测方法的建立
• 4.1 材料
• 4.1.1 主要试剂
• 4.1.2 主要溶液的配制
• 4.1.3 主要仪器
• 4.2 方法
• 4.2.1 抗EIL-18 PcAb 的纯化及标记
• 4.2.1.1 抗EIL-18 PcAb 的粗提
• 4.2.1.2 DEAE-Sephadex A-50 柱层析纯化PcAb 粗提物
• 4.2.1.3 抗EIL-18 PcAb 的生物素标记
• 4.2.2 抗EIL-18 McAbs 的纯化及标记
• 4.2.2.1 抗EIL-18 McAbs 的粗提
• 4.2.2.2 G 蛋白亲和层析法纯化McAbs 粗提物
• 4.2.2.3 抗EIL-18 McAbs 的生物素标记
• 4.2.3 生物素标记水平的测定
• 4.2.4 生物素标记PcAb 和McAb 效价的测定
• 4.2.5 捕获抗体与检测抗体配对的选择
• 4.2.6 包被液的选择
• 4.2.7 捕获抗体包被浓度的选择
• 4.2.8 检测抗体工作浓度的选择
• 4.2.9 封闭剂的选择
• 4.2.10 标准曲线的绘制及最小检出浓度的确定
• 4.2.11 特异性试验
• 4.2.12 重复性和稳定性试验
• 4.2.12.1 批内试验
• 4.2.12.2 批间试验
• 4.2.13 临床初步应用
• 4.2.14 猪、牛IL-18 定量抗原捕获ELISA 检测方法的初步建立
• 4.3 结果
• 4.3.1 抗EIL-18 PcAb 和McAbs 的纯化
• 4.3.2 抗EIL-18 McAbs 的纯化
• 4.3.3 抗EIL-18 PcAb 和McAbs 的生物素标记
• 4.3.4 生物素标记抗EIL-18 PcAb 和McAbs 的检测结果
• 4.3.5 包被液的选择
• 4.3.6 捕获抗体包被浓度的选择
• 4.3.7 检测抗体工作浓度的选择
• 4.3.8 封闭剂的选择
• 4.3.9 标准曲线的绘制及最小检出浓度的确定
• 4.3.10 鉴定特异性试验
• 4.3.11 重复性和稳定性试验
• 4.3.12 临床检测结果
• 4.3.13 猪、牛IL-18 定量抗原捕获ELISA 检测方法的初步建立
• 4.4 讨论
• 第五章 全文结论
• 参考文献
• 致谢
• 作者简介