产蛋白酶乳酸菌种的筛选及应用研究

论文摘要

随着人们健康意识的提高和对抗生素残留危害的逐步认识,乳酸菌作为一种绿色环保的饲料添加剂已经被广泛的应用到饲料生产中,它不仅能够提高动物的机体免疫力,预防动物胃肠道疾病的发生,同时对乳产量的增长也有一定的促进作用。目前,我国奶牛平均单产奶量仅为2800～3000kg/年,而国外奶牛平均单产则达到了7000kg/年,美国最高达到了8000kg/年。产奶量的高低除奶牛的品种、饲养的环境、饲喂的食料这些因素外,促进奶牛泌乳的微生态制剂也起到了很关键的作用。乳酸菌作为微生态制剂已经被广泛的应用到生产实践当中,但绝大多数微生态制剂添加乳酸菌都是因其产乳酸的特性,能够降低胃肠道中的pH值,抑制病原菌的生长而添加的,并没有报道因其能分泌蛋白酶,提高饲料的利用率而使用的。本实验旨在开发一种在产生乳酸,降低肠道pH的同时,还能够分泌蛋白酶,提高饲料蛋白利用率的乳酸菌。本实验以实验室保存的21种乳酸菌,进行产蛋白酶乳酸菌株的筛选。从以下几方面进行研究:产蛋白酶菌种的筛选;对其进行生化和分子水平的鉴定;所产蛋白酶的分离纯化及酶学性质研究;筛选所得菌种的超浓缩培养基;菌种驯化;将其作为微生态制剂应用到奶牛的饲喂中,观察其对奶牛生产性能的影响。本实验所得的研究结果如下:通过酪蛋白平板培养基产透明圈结合福林法测定蛋白酶活力方法,筛选得到产蛋白酶的乳酸菌种。通过对此乳酸菌株进行生化水平和特异PCR鉴定,得出此乳酸菌属于乳酸乳球菌乳酸亚种AS1.1936。通过Sephadex G-75分子筛柱层析纯化了培养液中乳酸菌所产的胞外蛋白酶,并且确定了此蛋白酶的分子质量在35KD左右。通过对所产蛋白酶的酶学性质研究确定此蛋白酶属于酸性蛋白酶,最适作用温度为40℃;Mn2+对该酶有明显的激活作用:筛选得到该菌种超浓缩培养基,通过此培养基培养后乳酸菌AS1.1936的活菌数达到了1.05×1010cfu/ml。本实验初步获得乳酸菌产蛋白酶的驯化方法,即先通过在酪蛋白琼脂平板培养基上驯化,之后复壮,再驯化,直至酪蛋白的浓度由0.5%达到5.0%（每0.5%为一个梯度）为止。将乳酸菌种作为微生态制剂添加到奶牛的精饲料中,可使奶牛乳产量提高4.08%,乳脂率提高19.51%,干物质率提高8.07%,差异均极显著（P＜0.01）。对乳蛋白率无显著影响。本实验成功的筛选出了产蛋白酶的乳酸菌种,并且动物实验结果显示,产蛋白酶乳酸菌种有可能作为微生态制剂用于奶牛产奶质量和产量的提高。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 1 引言
• 1.1 微生态制剂概述
• 1.2 乳酸菌概述
• 1.2.1 乳酸菌的生化特性及研究背景
• 1.2.2 乳酸菌产乳酸机制
• 1.2.3 大量乳酸的产生与酸中毒
• 1.2.4 乳酸菌作为微生态制剂的作用机理
• 1.3 蛋白酶概述
• 1.3.1 蛋白酶的分类
• 1.3.2 酸性蛋白酶的理化性质及分离方法
• 1.3.3 酸性蛋白酶的酶学性质
• 1.3.4 酸性蛋白酶的作用机理
• 1.3.5 酸性蛋白酶的应用
• 1.4 奶牛添加产酸性蛋白酶乳酸菌的可行性
• 1.4.1 应用于犊牛
• 1.4.2 应用于成熟奶牛
• 1.5 研究的目的与意义
• 2 材料与方法
• 2.1 材料
• 2.1.1 实验菌种
• 2.1.2 实验动物
• 2.1.3 实验试剂
• 2.1.4 培养基
• 2.1.5 染色试剂配方
• 2.1.6 实验仪器
• 2.2 方法
• 2.2.1 乳酸菌种的分离培养
• 2.2.2 产蛋白酶菌种的筛选
• 2.2.3 产蛋白酶菌种的鉴定
• 2.2.4 蛋白酶的分离、纯化
• 2.2.5 蛋白酶性质的研究
• 2.2.6 乳酸菌超浓缩培养基的筛选及对蛋白酶产量的影响
• 2.2.7 菌株的驯化
• 2.2.8 所得乳酸菌作为微生态制剂在奶牛饲喂中的应用
• 3 结果
• 3.1 21种乳源菌株的分离培养
• 3.2 产蛋白酶菌株的筛选
• 3.3 筛选所得菌株的鉴定
• 3.3.1 菌株的形态学观察
• 3.3.2 生化实验
• 3.3.3 特异PCR实验
• 3.4 蛋白酶的分离、纯化
• 3.5 蛋白酶性质的研究
• 3.6 乳酸菌超浓缩培养基的筛选及对蛋白酶产量的影响
• 3.6.1 主要营养物质的筛选
• 3.6.2 超浓缩培养基盐浓度的筛选
• 3.6.3 培养基营养强化物质筛选的单因素实验
• 3.6.4 培养基起始pH值的筛选
• 3.6.5 培养温度的筛选
• 3.6.6 对数生长期和稳定期的菌体数量与蛋白酶活性的关系
• 3.7 菌株的驯化
• 3.8 动物实验
• 4 讨论
• 4.1 产蛋白酶菌株的筛选方法
• 4.2 乳源球菌菌种的鉴定
• 4.2.1 菌落形态观察
• 4.2.2 生化实验鉴定
• 4.2.3 特异性 PCR
• 4.3 柱层析填料的筛选
• 4.4 乳酸菌所产蛋白酶的酶学性质研究
• 4.5 超浓缩培养基的筛选及对酶产量的影响
• 4.6 产蛋白酶乳酸菌的驯化
• 4.7 产蛋白酶乳酸菌种对奶牛产奶性能的影响
• 5 结论
• 致谢
• 参考文献
• 附录
• 攻读硕士学位期间发表的学术论文