pBV220-HPVL1和pBV220-HSVgD重组蛋白的高效表达、分离纯化及其鉴定

论文摘要

目的人乳头瘤病毒（Human papillomavirus,HPV）感染是引起宫颈癌的主要病因,高危型HPV16是主要的感染类型。而HPV并非宫颈癌发生发展的唯一因素,单纯疱疹病毒（Herpes simplex virus,HSV）可能作为协同因子在宫颈癌变发生发展的过程中起重要作用。用PCR法从HPV中扩增出L1基因片段及从HSV中扩增出gD基因片段作为目的基因,并将目的基因插入到pBV220原核表达载体中;为了获得pBV220-HPVL1和pBV220-HSVgD重组蛋白,故将上述重组载体在E.coli DH5α中进行诱导表达、蛋白纯化及其鉴定,以期为研制宫颈癌预防性疫苗奠定基础。方法重组质粒pBV220-HPVL1和pBV220-HSVgD转化E.coil DH5α,温控诱导,以包涵体形式获高效表达。在超声液中加入终浓度为2mol/L的尿素分离洗涤包涵体,然后将其溶于8mol/L尿素中,用考马斯亮蓝法测定蛋白浓度。将一定量的目的蛋白与免疫佐剂混合后免疫家兔。免疫方式采用皮下多点注射,经7次免疫后,取兔耳缘静脉血行双向琼脂免疫扩散法检测抗体滴度,滴度合适后,进行心脏采血。采集分离的血清进行双向琼脂免疫扩散,此外,用Western-blot检测和鉴定pBV220-HPVL1和pBV220-HSVgD目的蛋白。结果1、将重组质粒pBV220-HPVL1和pBV220-HSVgD转入大肠杆菌DH5α,分别经42℃诱导表达6小时和5小时,成功表达了相应的pBV220-HPVL1和pBV220-HSVgD重组蛋白。SDS-PAGE分析表明:两者均以包涵体形式存在,pBV220-HPVL1重组蛋白的分子量约为64KD,pBV220-HSVgD重组蛋白的分子量约为13KD。2、将包涵体超声裂解、分离洗涤后,获得了较纯的目的蛋白,经8M尿素处理后,紫外吸收法测定HPVL1与HSVgD蛋白浓度分别为5.9mg/ml与4.6mg/ml。3、以pBV220-HPVL1和pBV220-HSVgD重组蛋白分别免疫家兔,制备了抗HPVL1、HSVgD多克隆抗体,以重组蛋白为抗原,用双向琼脂免疫扩散法检测HPVL1、HSVgD抗血清的效价均达到1:16,且HPVL1、HSVgD抗体与免疫原之间形成单一沉淀线,表明所制备的多抗具有良好的纯度。4、免疫印迹分析HPVL1抗血清在分子量约64KD,HSVgD抗血清在分子量约13KD处与相应的原核表达蛋白呈现特异性结合条带,表明所表达的蛋白均为目的蛋白。结论应用基因工程技术,将重组质粒pBV220-HPVL1和pBV220-HSVgD转入大肠杆菌DH5α,成功地高效表达了pBV220-HPVL1和pBV220-HSVgD重组蛋白。经免疫家兔获得的抗HPVL1和抗HSVgD两种多克隆抗体都具有良好的特异性和较高的抗体效价,为进一步动物实验的研究奠定了基础。

论文目录

• 中文摘要
• 英文摘要
• 前言
• 实验一 pBV220-HPVL1 和pBV220-HSVgD 的高效表达及其产物的制备
• 材料
• 方法
• 结果
• 讨论
• 小结
• 实验二 HPVL1 和 HSV-gD 重组蛋白多克隆抗体的制备
• 材料
• 方法
• 结果
• 讨论
• 小结
• 实验三 目的蛋白的鉴定
• 材料
• 方法
• 结果
• 讨论
• 小结
• 参考文献
• 综述
• 个人简介
• 致谢