利用Red重组系统快速构建G蛋白偶联受体基因打靶载体

论文摘要

G蛋白偶联受体（GPCR）是一类具有七次跨膜结构域的受体超家族,占人类基因组的3%-4%,具有广泛的生理功能,并且是最重要的药物作用靶点。粘附亚家族成员绝大多数为功能不明、配体未知的孤儿受体。阐明该家族成员的生理功能对于基础理论研究和潜在药物靶点的发现具有十分重大的意义。GPCR粘附家族是一类非常独特的GPCRs亚家族,它是GPCRs家族中唯一具有与其他膜蛋白家族（例如酪氨酸激酶受体钙粘素受体等）相类似长的N末端结构的成员,很明显对于G蛋白粘附家族的研究还需要很多工作要完成。所以我们设计了GPCR粘附家族成员中Gpr56, Bail, Gpr111的完全基因敲除打靶载体以及Gpr126的条件性基因敲除载体,用来研究上述基因的功能。基因敲除小鼠模型是在动物体内研究基因功能的最重要和可靠的手段之一。由于PCR、酶切和连接长片段目的序列的难度,利用常规的分子克隆的方法构建基因敲除打靶载体一般耗时较长,甚至无法完成特定基因打靶载体的构建。基因敲除技术包括完全敲除基因打靶和条件性敲除基因打靶技术。本研究合理应用Red重组系统,通过两次重组,实现完全基因敲除打靶载体的快速构建。根据多次反复实验,改进了利用Red重组系统构建条件性基因敲除打靶载体构建的方法,能够将两个LoxP位点更加准确的插入到目标位置。

论文目录

• 摘要
• ABSTRACT
• 第一章 文献综述
• 1.1 基因敲除技术
• 1.2 G蛋白偶联受体
• 1.3 Gpr56,Bai1,Gpr111,Gpr126研究现状
• 第二章 材料和方法
• 2.1 材料
• 2.2 完全基因敲除打靶载体构建实验方法
• 2.3 条件性基因敲除打靶载体构建实验方法
• 第三章 实验结果及其分析
• 3.1 完全敲除基因打靶载体的实验结果及其分析
• 3.2 条件性基因敲除打祀载体的实验结果及其分析
• 第四章 讨论
• 4.1 本研究采用的构建打靶载体策略的优势
• 4.2 本研究中提高同源重组效率的策略
• 4.3 构建条件性敲除打靶载体的改进方法
• 参考文献
• 附录Ⅰ 工具载体序列及图谱
• 附录Ⅱ 攻读硕士学位期间发表文章
• 后记