高产谷胱甘肽面包酵母的选育及发酵条件优化

论文摘要

本论文通过复合诱变育种并利用镉盐抗性筛选到了高产谷胱甘肽的面包酵母菌株,并进一步对发酵培养基及发酵条件进行优化。以实验室保藏的一株面包酵母BV54为出发菌株,镉盐抗性为筛选标记,经紫外和硫酸二乙酯复合诱变,筛选出一株高镉盐抗性面包酵母菌株BV54-11-11,经摇瓶发酵其谷胱甘肽产量达98.80mg/L,胞内含量为15.22mg/g。在摇瓶中对诱变后的突变株BV54-11-11的培养基和培养条件进行了优化,利用单因素试验确定了碳源为葡萄糖,有机氮源为玉米浆,无机氮源为磷酸二氢铵,首先用Plackett-Burman法筛选出三个影响较大的重要因素,分别为葡萄糖、装液量和摇瓶转速。然后运用最陡爬坡实验逐步改变这三个参数,逼近最大响应面区域,最后通过Box-Behnken实验设计,利用SAS软件进行回归分析,确定了该突变株产GSH的培养基组成及发酵条件。优化后的发酵条件为：葡萄糖30.15g/L、装液量49.72mL/250mL、摇床转速178.76r/min,进行发酵实验,菌体GSH产量可达122.02mg/L,干细胞胞内GSH含量为21.44mg/g,较BV54分别提高107.5%和115.7%。在前期对发酵条件及发酵培养基初步优化的基础上进行5L自动生物发酵罐分批培养和补料分批培养,实验结果表明,自动发酵罐补料分批培养更有利于菌体生长和产物GSH的合成,菌体干重和GSH产量最高可达到15.25g/L和340.04mg/L。与摇瓶培养相比,细胞干重提高了1.68倍,GSH产量提高了1.8倍。初步研究了添加L-半胱氨酸对酵母菌BV54-11-11发酵生产GSH的影响,结果表明,摇瓶中发酵9h时添加0.6%半胱氨酸最适合于菌体生长和胞内GSH的形成。

论文目录

• 摘要
• ABSTRACT
• 1 前言
• 1.1 谷胱甘肽概述
• 1.2 谷胱甘肽的性质与分布
• 1.3 谷胱甘肽的功能及应用
• 1.4 谷胱甘肽的生产
• 1.4.1 萃取法
• 1.4.2 化学合成法
• 1.4.3 酶法
• 1.4.4 发酵法
• 1.5 谷胱甘肽的生物合成步骤及代谢途径
• 1.5.1 酵母硫代谢转录调控基因——MET4
• 1.5.2 Met4在谷胱甘肽合成中的作用
• 1.6 发酵法生产谷胱甘肽的研究进展
• 1.6.1 高产菌株的选育
• 1.6.2 发酵工艺条件研究
• 1.7 本论文的立题依据与研究内容
• 1.7.1 立题依据
• 1.7.2 研究内容
• 2 材料与方法
• 2.1 材料与仪器
• 2.1.1 菌种
• 2.1.2 主要实验材料
• 2.1.3 主要仪器设备
• 2.1.4 主要试剂
• 2.1.5 培养基
• 2.2 培养方法
• 2.2.1 固体培养
• 2.2.2 种子摇瓶培养
• 2.2.3 发酵摇瓶培养
• 2.2.4 发酵罐培养
• 2.2.5 菌种传代培养
• 2.3 分析方法
• 2.3.1 细胞生物量的测定
• 2.3.2 谷胱甘肽生成量测定—ALLOXAN试剂衍生法
• 2.3.3 pH值的测定
• 2.3.4 残糖浓度测定
• 2.3.5 酒精度测定
• 2.3.6 其它
• 2.4 实验方法
• 2.4.1 菌体的活化
• 2.4.2 生长曲线的绘制
• 2.4.3 面包酵母镉盐抗性菌株筛选方法
• 2.4.4 紫外诱变育种及筛选方法
• 2.4.5 化学诱变育种及筛选方法
• 2.4.6 发酵条件的响应面法优化
• 2.5 发酵罐实验
• 2.5.1 发酵罐分批培养
• 2.5.2 发酵罐流加培养
• 2.6 前体氨基酸的添加对GSH产量的影响
• 3 结果与讨论
• 3.1 紫外诱变与筛选
• 3.1.1 出发菌株的选择
• 3.1.2 出发菌株BV54生长曲线
• 3.1.3 紫外照射剂量的选择
• 3.1.4 镉盐抗性筛选平板的确定
• 3.1.5 初筛
• 3.1.6 复筛
• 3.2 化学诱变与筛选
• 3.2.1 菌株BV54-11生长曲线
• 3.2.2 DES用量的选择
• 3.2.3 镉盐抗性筛选平板的确定
• 3.2.4 初筛
• 3.2.5 复筛
• 3.3 突变株遗传稳定性考察
• 3.3.1 镉盐抗性验证
• 3.3.2 谷胱甘肽生成量测定
• 3.4 培养基的优化
• 3.4.1 单因素实验
• 3.4.2 响应面法优化产谷胱甘肽发酵条件的研究
• 3.5 发酵罐实验
• 3.5.1 发酵罐分批培养
• 3.5.2 发酵罐连续培养
• 3.6 前体氨基酸的添加对GSH产量的影响
• 4 结论
• 5 展望
• 6 参考文献
• 7 攻读硕士学位期间论文发表情况
• 8 致谢