论文摘要
抗菌肽Cecropin B是一种线性多肽，分子量约为4kD，在疏水环境中易形成两亲性（Amphipathic）α-螺旋，具有热稳定性，水溶性好。Cecropin B具有抗细菌、抗真菌等作用，近年来发现还有抗肿瘤及抗艾滋病病毒的活性，引起了国内外研究者的广泛关注。从生物组织中分离获得大量抗菌肽难度大，人工合成成本高，因此利用基因工程的方法表达抗菌肽成为近年来的研究热点之一。本研究构建了原核和真核表达载体，在大肠杆菌中表达家蚕（Bombyx mori）和果蝇（Drosophila melanogaster）抗菌肽Cecropin B2，并比较了两种抗菌肽的活性。同时也在昆虫杆状病毒体系中表达了家蚕（Bombyx mori）抗菌肽Cecropin B2。获得以下主要结果：1．根据大肠杆菌基因翻译偏爱的密码子，分别对其进行优化后，并用overlapextension PCR的方法扩增获得了家蚕和果蝇抗菌肽基因BmCecB2和DmCecB2，将人工合成的PCR产物与表达载体pET32a重组，构建了表达载体pET-32a-BmCecB和pET-32a-DmCec B，转化E.coli BL21（DE3），IPTG诱导表达。表达产物经SDS-PAGE电泳和Western blotting检测，在预期的相应位置出现了特异的蛋白条带，表明Cecropin B基因在E.coli BL21（DE3）宿主菌中获得成功表达。分离纯化融合蛋白后，用肠激酶将N端的融合部分切除，得到完整抗菌肽，通过沸水煮过后，抑菌实验结果显示，表达的Cecropin B蛋白具有抑菌活性。BmCecB2和DmCecB2表达产物的抗菌活性存在明显差异： DmCecb2和BmCecb2表达产物的质量浓度为10mg/mL时，其对大肠杆菌（E. coli） DH5α的抑菌圈直径分别为15和8mm左右，最小抑菌浓度分别为0.05、0.1mg/mL。结果说明DmCecb2的原核表达效率及表达产物的抑菌活性均明显高于BmCecb2。2．采取Bac-to-Bac表达系统将抗菌肽Cecropin B基因在昆虫细胞中表达，，该系统具有高效表达、无内毒素污染、翻译后修饰等优势。将家蚕抗菌肽Cecropin B基因及连接荧光标记基因的Cecropin B分别克隆至杆状病毒转移载体pFastBacI，构建的重组质粒pFastBacI-BmcecB和pFastBacI-BmcecB-EGFP分别转化大肠杆菌DH10Bac感受态细胞，发生体内重组，获得杆粒Bacmid-BmcecB和Bacmid-BmcecB-EGFP。两种杆粒DNA在脂质体Lipofectin介导下侵染家蚕细胞，获得含BmcecB基因的重组杆状病毒，重组病毒感染Bm细胞后，表达目的蛋白。在荧光显微镜下，可以看到转基因阳性细胞带有绿色荧光。超声裂解细胞，抑菌试验结果显示，表达的BmcecB蛋白具有抑菌活性。为今后进一步的实验研究提供依据。