结核分枝杆菌持留相关基因及其应用研究

论文摘要

从1882年科赫发现结核分枝杆菌（Mycobacterium tuberculosis, M. tuberculosis, MTB,简称结核菌）至今,结核菌仍然是最重要的人类致病菌,2006年约有1,500,000人死于结核病。最近涌现出来的耐多药结核菌（Multidrug-resistant TB, MDR-TB）,超级耐药结核菌（Extensively drug-resistant TB, XDR-TB）以及与HIV共感染的结核菌（HIV-associated TB）更成为我们目前需要关注的问题,中国仍然是世界上M/XDR-TB负担最重的国家之一。抗结核药物的滥用是导致MDR-TB和XDR-TB出现的最主要原因,目前这种滥用对公共卫生产生了极大的威胁,同时也引起了社会的广泛关注。现在涌现出来的结核病或耐药性结核病,很大一部分原因是无效或者低效的结核病治疗引起的。结核病治疗的目标是迅速杀灭其致病菌结核菌,防止耐药性的出现、消除持久性杆菌、预防复发、减少疾病传播。但是在现在的治疗情况看来,这些目标很难实现。现在标准的结核病治疗方法是全程督导短期化疗法（Directly Observed Treatment Short-course, DOTS）,这种治疗方法至少需要6个月,具体操作为使用四种一线抗结核药物：异烟肼（Isoniazid, INH）、利福平（Rifampicin, RIF）、比嗪酰胺（Pyrazinamide, PZA）以及乙胺丁醇（Ethambutol, EMB）治疗两个月,接着用INH和RIF持续治疗四个月。如果严格按照这种方案进行治疗的话,治愈率可达85%。然而如此漫长的治疗周期、药物产生的严重副作用以及病人的依从性降低都极易产生耐药菌。而DOTS无法在HIV和MDR-TB病人中开展,需要更加严格的DOTS-plus策略,该策略除需要DOTS中的药物外,还需要一些二线药物的辅助,这种方法治疗MDR-TB需要两年以上的时间,不仅花费巨大,同时还会产生很强的药物毒性。需要如此长的时间进行结核病的治疗,具体原因还不是很清楚,但是大多数的研究者认为是结核菌持留状态或称持留菌（Persister）造成的,持留菌会对现有抗结核药物产生明显的耐受。结核菌很重要的一个特征是,它可以长期处于一种潜伏状态,而不会导致结核病的发生。揭示使结核菌长期处于持留状态的机制,对于治疗结核病有十分重要的意义。而目前研究新型抗结核药物的重点主要集中在：寻求如何缩短结核病治疗时间、发现可以对抗MDR-TB的药物、缩短结核病潜伏感染治疗时间的药物以及愈后安全性较高的药物。所以,研究新的抗结核药物还是一个比较大的挑战。从生长环境角度来看,结核菌是一种兼性细胞内寄生细菌。结核菌进入人体后,巨噬细胞（Macrophage）对其识别后发生吞噬作用,从而被机体免疫系统清灭掉,那些未被清除的小部分结核菌便潜伏在巨噬细胞内。但是当巨噬细胞发生凋亡时,这些潜伏的结核菌还是会被杀死,从而阻止了结核菌在体内的扩散,这些凋亡细胞邻近的未被感染的巨噬细胞同时也被激活,使机体对结核菌的杀伤能力大大增强。从上面这些现象我们可以看出,巨噬细胞的凋亡对寄生于其中的结核菌的命运十分关键。也正因为如此,结核菌为使其自身能在巨噬细胞中存活下来,在其进化过程中产生了一套可以对巨噬细胞的凋亡进程进行干预的机制。结核菌在巨噬细胞中生长可能会遇到各种不利环境,包括氧化剂、强酸、低氧、缺乏营养和基本元素、破坏菌体表面结构的物质、营养匮乏以及干燥和低温等。结核菌可以逃避如此多的恶劣环境,与其菌体结构及其自身的调控是密不可分的。由肽聚糖（Peptidoglycan, PG）.阿拉伯半乳聚糖（Arabinogalactan, AG）和分枝菌酸（Mycolic acid, MA）三种成分相互交联构成的结核菌细胞壁十分复杂和巧妙,可以在有效抵抗外来有毒化学物质侵害的同时,避开宿主的免疫系统,使其很容易在巨噬细胞中生长。而这三种成分中,最引人注目的是分枝菌酸,它是一种长链α-烷基-β-羟脂肪酸,仅存在于分枝杆菌中,具有十分重要的分类学意义,同时在构成分枝杆菌外膜及发挥分枝杆菌的毒性方面也发挥重要的作用。结核菌分枝菌酸主要通过Ⅰ型脂肪酸合酶（FAS-Ⅰ）和Ⅱ型脂肪酸合酶（FAS-Ⅱ）两个途径的共同作用合成。这两个途径中涉及到大量的脂肪酸合成酶,以及对这些酶进行调控的调节因子。本文研究的脂肪酸代谢调控因子（Fatty acid metabolism regulator, FadR）便是其中十分重要的一个。该因子在大肠杆菌（Escherichia coli, E. coli）中报道较多,其在饱和脂肪酸降解中起负调控的作用,同时在不饱和脂肪酸的合成中,却发挥正调控的作用,是一种十分重要的调节子。但是这种调节子目前在结核菌中还未见相关报道。曾有研究人员将M. tuberculosis与M. smegmatis中可能的脂肪酸代谢调节因子进行了分类,预测出几种可能的、与大肠杆菌比较接近的调节因子。本文对分枝杆菌的GntR家族进行了分类,确定出该家族的FadR亚家族蛋白,进一步确定FadR亚家族成员Rv0494为潜在的FadR编码基因,通过实验手段对这种预测进行了验证,最终证明其可以调节菌体内脂肪酸的水平,使脂肪酸14:0 iso 30H（异3-羟基14酸）降解掉,产生了一种新的脂肪酸。在大肠杆菌的研究中发现,脂肪酸代谢调控因子编码基因fadR的突变会引起乙醛酸循环旁路关键酶组成的操纵子编码基因aceBAK表达上升。结核菌在巨噬细胞内的恶劣环境中,主要是依靠乙醛酸旁路获得其生长所需能量。一旦该旁路被阻断,会大大的降低结核菌的存活率。FadR是通过调节异柠檬酸裂解酶调节子（isocitrate lyase regulator, IclR）的表达间接调节aceBAK的表达的。异柠檬酸裂解酶（Isocitrate lyase, ICL; EC 4.1.3.1）是乙醛酸旁路中的第一个关键酶,它在结核菌致病过程中,发挥着十分重要的作用。当结核菌无法通过三羧酸循环（Citric acid cycle, TCA）获得生长所需能量时,可以通过乙醛酸旁路途径（Glyoxylate bypass）利用乙酸或脂肪酸作为其唯一的碳源,将碳源代谢掉,使代谢产物可以重新进入TCA循环。所以,ICL能增强细菌在巨噬细胞中的生存能力,从而促进感染性持留菌的形成。针对上述原理,本实验室构建了以ICL为药物靶标的高通量药物筛选（High-throughput screen, HTS）模型,利用该模型对小分子多肽化合物库进行高通量筛选,得到了一系列对该模型较敏感的化合物,包括两种曼尼西碱Ydcm66和Ydcm67。在进一步试验中,最终确定Ydcm67是一种十分有前景的抗结核药物。tmRNA（又称为10Sa RNA或SsrA）是细菌体内一种代谢上稳定的RNA。它的结构独特,其5′和3′末端序列有一个类似丙氨酰tRNA的结构,中间序列编码多肽标签（Tag peptide）。与其独特的结构相适应,tmRNA兼有tRNA和mRNA的双重功能,在细胞中参与一种特殊的翻译反应——反式翻译反应（trans-translation）,结果形成一个C-末端接有标记肽的嵌合蛋白质。在对Mycobacterium tuberculosis的ssrA测序时发现,其3′末端与tRNA的T臂结构类似。tmRNA普遍存在于细菌中,在细菌的生理代谢中发挥重要的作用,但是其在结核菌持留中发挥作用方式还鲜有研究。通过我们的研究发现,tmRNA的缺失可以导致抗生素压力条件下持留子的大幅减少,tmRNA在大肠杆菌持留子形成中发挥重要的作用。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 缩略词表
• 第1章 文献综述
• 1 结核病现状
• 1.1 全球结核病现状
• 1.2 国内流行现状
• 2 持留现象与持留菌
• 3 脂肪酸代谢与结核分枝杆菌持留
• 3.1 GntR家族
• 3.2 结核分枝杆菌与巨噬细胞免疫
• 3.3 分枝菌酸及其分类
• 3.4 分枝菌酸的合成及其调节
• 4 乙醛酸循环旁路与结核分枝杆菌持留
• 4.1 乙醛酸循环旁路
• 4.2 异柠檬酸裂解酶在乙醛酸循环中的作用
• 4.3 异柠檬酸裂解酶的基因结构
• 4.4 异柠檬酸裂解酶基因的表达调控
• 5 tmRNA与细菌的持留
• 5.1 tmRNA的发现
• 5.2 tmRNA的结构
• 5.3 tmRNA的作用机制
• 6 ICL、FadR与新药研发
• 6.1 ICL与新药研发
• 6.2 FadR与新药研发
• 6.3 高通量药物筛选模型
• 参考文献
• 第2章 绪论
• 1 选题依据、研究目的与意义
• 2 科学问题
• 3 研究内容与技术路线
• 参考文献
• 第3章 结核分枝杆菌脂肪酸代谢调节因子（Fatty acid metabolism regulator;FadR）的预测与功能研究
• 1 引言
• 1.1 大肠杆菌中FadR蛋白的作用及其结构
• 1.2 结核分枝杆菌中FadR潜在的功能
• 2 材料与方法
• 2.1 实验材料
• 2.2 实验方法
• 3 实验结果
• 3.1 分枝杆菌GntR家族蛋白
• 3.2 利用PCR方法获得Rv0494编码序列
• 3.3 重组质粒的构建及鉴定
• 3.4 重组质粒序列测定结果（由上海英骏生物技术有限公司完成）
• 3.5 重组质粒对宿主菌的影响
• 3.6 重组蛋白的表达及其表达形式鉴定
• 3.7 重组蛋白的纯化
• 3.8 脂肪酸分析
• 4 讨论
• 参考文献
• 第4章 结核分枝杆菌异柠檬酸裂解酶（Isocitrate lyase,ICL;EC 4.1.3.1）高通量筛选模型的构建及活性化合物的筛选
• 1 引言
• 1.1 结核病现状
• 1.2 结核分枝杆菌致病机理及异柠檬酸裂解酶在其中所发挥的作用
• 1.3 高通量药物筛选
• 1.4 β-氨基酮类化合物应用现状
• 2 材料与方法
• 2.1 实验材料
• 2.2 实验方法
• 3 实验结果
• 3.1.用巢式PCR方法获得ICL编码序列
• 3.2.重组质粒的构建及鉴定
• 3.3 重组质粒序列测定结果（由上海英骏生物技术有限公司完成）
• 3.4 重组质粒对宿主菌的影响
• 3.5 重组蛋白的表达及其表达形式鉴定
• 3.6 重组蛋白纯化
• 3.7 酶活力检测及其优化
• 3.8 筛选模型的评估
• 3.9 DMSO对ICL活性的影响
• 3.10 重组ICL化合物抑制剂高通量筛选
• 4 讨论
• 参考文献
• 第5章 SsrA（tmRNA）在细菌持留性中的作用研究
• 1 引言
• 2 材料与方法
• 2.1 实验材料
• 2.2 实验方法
• 3 实验结果
• 3.1 SsrA缺失菌株的构建
• 3.2 SsrA基因编码序列的扩增
• 3.3 重组质粒的构建
• 3.4 菌株持留性检测结果
• 4 讨论
• 参考文献
• 第6章 总结
• 附录
• 致谢
• 发表论文及参加课题一览表