木质纤维素分解复合菌群NSC-7菌种组成及种间协作机理

论文摘要

地球上每年产生的植物光合作用产物可达2000亿吨,木质纤维素是超过其一半的主要成分,在木材、秸秆、农林产品加工副产品、畜禽粪便中都含有大量木质纤维素。由于木质纤维素分解难,它的分解成为限制含木质纤维素生物质利用及环境治理上的瓶颈环节。如,富含木质纤维素的生物质由于不占粮食而且能量密度较大,就成为全世界都在关注的生物质能源开发和利用的对象。但由于木质纤维素的分解糖化很难限制了该资源的进一步开发。秸秆还田是增加土壤有机质恢复土壤地力的有效途径,但在我国特殊的农作制度下,秸秆中的木质纤维素分解慢,影响下茬作物的生长,从而限制着秸秆直接还田的推广,采用化学方法处理木质纤维素也存在再次污染环境的问题,而利用微生物分泌的纤维素复合酶加快分解木质纤维素无论对生物质资源的转化利用还是环境治理都具有重要意义。本研究在尊重自然界群体效应的前提下,利用限制性培养法筛选到一组具有分解木质纤维素和农药（林丹）双重功能的复合菌系NSC-7,本文对NSC-7的菌种组成多样性和种间协作机理进行深入研究。NSC-7在14 d的培养过程中,可降解稻秆总干重的73.6%,其中降解纤维素58.2%,半纤维素82.1%,木质素5.4%。用GC-MS检测发酵液产物,发现有乙醇、乙酸、丙酸、丁酸、戊酸、甘油、尿素、乙二酸乙二脂、2-甲基丙酸、乙二醇等10种化合物,其中含量较大的依次为乙酸、甘油、丁酸、丙酸。复合系可同时分泌纤维素酶和半纤维素酶,且各种纤维素酶活性都呈单峰曲线,其中纤维素内切酶（CMC）、总纤维素酶（FPU）、外切酶（AC）和β-糖苷酶活性（CB）都在第8 d达到最大值,分别为4.48 U/mL、15.83 U/mL、7.51 U/mL和25.78 U/mL。半纤维素酶活性（XY）在第5 d达到最高值为280.9 U/mL。在有氧条件下,利用传统的平板画线法分离到11株单菌,将获得的11株单菌按照体积比1:1重新组合后不具备分解纤维素的能力。利用单层和双层滤纸平板法检测NSC-7复合菌群的分解能力,发现只有双层平板上的滤纸能够分解,说明NSC-7复合系内降解纤维素的关键菌属于厌氧或微好氧菌。为了获取复合菌群内全部菌株的组成信息,本研究利用现代分子生态学技术对NSC-7构建克隆文库,获得195个16S rDNA片断,经DGGE筛选获得25个代表性克隆,其序列比对结果显示有60%的近缘种为已知菌,分别归属于Clostridium、Petrobacter、Bacteria、Paenibacillus,proteobacterium 5个属,其余40%菌的近缘种属于难培养菌。从已分离的11株单菌株组合后不具备分解纤维素能力的实验结果推断,分解纤维素的关键菌很可能在没有分离到的Clostridium属内。根据Clostridium在分解纤维素过程中具有吸附于纤维素粉的特性,利用冲洗和离心沉淀等方法获得一组具备分解纤维素能力但无法分开的“3株梭菌组合”,将该组合与3株不具分解纤维素能力的单菌株分别重新组合,发现有两株单菌株Pseudoxanthomonas taiwanensis和Petrobacter sp.都有促进其分解的能力。通过理化指标测定发现,这两株菌具备高效利用纤维二糖的性质,消除纤维素的中间产物（纤维二糖）对纤维素分解的阻遏或抑制作用,很可能是这两株菌促进纤维素分解的一个重要原因。NSC-7复合系经90～110℃高温处理30 min后,仍具备分解纤维素的能力,只是随着处理温度的升高,剩余菌群内菌株的数量和种类,以及发酵液中挥发产物种类也随之减少,分解能力也逐渐减弱,但随着继代次数的不断增加分解能力又有所恢复,说明复合系自身具备一定的抗逆境能力。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 1 绪论
• 1.1 引言
• 1.2 木质纤维素资源及其价值
• 1.3 木质纤维素资源开发的重要意义
• 1.3.1 木质纤维素的结构
• 1.3.2 秸秆的结构
• 1.3.3 秸秆类木质素资源开发的意义
• 1.4 木质纤维素的水解途径
• 1.4.1 影响木质纤维素分解的因素
• 1.4.2 木质纤维素生物分解的机理
• 1.4.3 分解木质纤维素的微生物
• 1.4.4 纤维素酶的结构
• 1.4.5 多纤维素酶体
• 1.4.6 提高纤维素酶活性的方法
• 1.4.7 定向诱变
• 1.4.8 直接进化
• 1.4.9 化学物理诱变育种
• 1.4.10 筛选高活性纤维素酶存在的问题和展望
• 1.5 分子生态学在木质纤维素分解菌群研究中的应用现状
• 1.5.1 变性梯度凝胶电泳（DGGE）的原理
• 1.5.2 变性梯度凝胶电泳（DGGE）在木质纤维素分解菌群研究中的应用
• 1.5.3 用DGGE和克隆文库分析菌群多样性的意义
• 1.6 本研究的目的和意义
• 1.6.1 NSC-7复合系的功能和存在的问题
• 1.6.2 本项研究要解决的问题
• 1.6.3 本研究的意义
• 2 技术与方法
• 2.1 培养基及培养条件
• 2.1.1 培养基
• 2.1.2 培养条件
• 2.2 木质纤维素和林丹分解菌复合系的构建
• 2.3 传统的微生物分离、计数方法
• 2.3.1 单菌性质的测定
• 2.3.2 有纤维素分解能力细菌的分离
• 2.3.3 稻秆分解实验设置
• 2.3.4 高温处理的实验设置
• 2.3.5 种间协同关系的实验设置
• 2.4 总DNA的提取---氯苯法
• 2.4.1 培养液中微生物总DNA的提取
• 2.4.2 发酵秸秆中微生物总DNA的提取
• 2.5 PCR-DGGE及DGGE条带测序
• 2.5.1 基于PCR的16S rDNA基因可变区域Ⅲ（V3）的扩增
• 2.5.2 电泳、染色
• 2.5.3 DGGE条带测序
• 2.5.4 16S rDNA测序
• 2.5.5 系统树的建立
• 2.5.6 核苷酸序列的基因库登录号
• 2.5.7 环境微生物群体多样性分析法
• 2.6 稻秆分解过程中指标评定
• 2.6.1 pH测定
• 2.6.2 微生物量（OD）测定
• 2.6.3 林丹含量测定
• 2.6.4 滤纸平板法验证菌系降解纤维素情况
• 2.6.5 挥发性发酵产物测定
• 2.6.6 可溶性糖测定
• 2.6.7 秸秆总重量及各成分的变化
• 2.6.8 纤维素酶活测定
• 2.6.9 半纤维素酶活性粗酶活性的测定
• 2.7 技术路线
• 3 NSC-7复合系的分解能力及特性研究
• 3.1 结果与分析
• 3.1.1 培养过程中OD和pH变化动态
• 3.1.2 NSC-7对水稻秸秆的分解能力
• 3.1.3 秸秆中纤维素、半纤维素、木质素和灰分的变化
• 3.1.4 可溶性物质的动态变化
• 3.1.5 水稻秸秆分解过程中发酵液中挥发性产物的变化
• 3.1.6 林丹含量的变化
• 3.2 本章小结
• 4 NSC-7复合系的菌种组成多样性研究
• 4.1 结果与分析
• 4.1.1 好氧条件分离菌株的基本信息
• 4.1.2 单菌的理化性质测定
• 4.1.3 11株单菌重新组合后分解纤维素情况
• 4.1.4 滤纸平板培养基上NSC-7复合系分解情况
• 4.1.5 16s rDNA克隆文库的构建及目的克隆的筛选
• 4.1.6 系统发育分析
• 4.1.7 厌氧条件下剩余菌信息
• 4.2 本章小结
• 5 酶活性表达与菌种组成关系
• 5.1 结果与分析
• 5.1.1 NSC-7的4种纤维素酶活性
• 5.1.2 半纤维素酶活性
• 5.1.3 纤维素和半纤维素酶活性的比较
• 5.1.4 NSC-7复合系的实际分解能力与酶活性
• 5.1.5 分解过程中菌群的动态变化
• 5.1.6 16S rDNA克隆文库的构建及菌种组成分析
• 5.1.7 菌种动态变化与纤维素酶活性和分解能力的关系
• 5.2 本章小结
• 6 高温对NSC-7复合系性质和菌群组成的影响
• 6.1 结果与分析
• 6.1.1 高温处理后热稳定性
• 6.1.2 高温处理后pH值的变化
• 6.1.3 高温处理后微生物量值的变化
• 6.1.4 高温处理后纤维素酶活性和半纤维素酶活性
• 6.1.5 高温处理后发酵液的测定
• 6.1.6 高温处理后的DGGE图谱变化
• 6.1.7 110℃高温处理后剩余菌克隆文库的构建
• 6.1.8 110℃高温处理后剩余菌系统发育分析
• 6.1.9 逆境条件剩余菌的基本信息
• 6.2 本章小结
• 7 核心微生物种的追踪及其菌种间协作机理的研究
• 7.1 结果与分析
• 7.1.1 组合实验所需单菌的筛选
• 7.1.2 "人工组合菌系"培养过程中pH值变化
• 7.1.3 "人工组合菌系"纤维素酶活性变化
• 7.1.4 "人工组合菌系"半纤维素酶活性变化
• 7.1.5 分解后剩余物重量
• 7.1.6 好氧单菌促进纤维素分解的探讨
• 7.2 本章小结
• 结论与展望
• 参考文献
• 攻读学位期间发表的学术论文
• 致谢