兔支气管败血波氏杆菌fimN基因的克隆表达及快速检测方法的建立

论文摘要

兔支气管败血波氏杆菌病是由支气管败血波氏杆菌（Bordetella bronchiseptica,Bb）引起的一种家兔呼吸道传染病,常呈地方性流行,多为慢性,急性败血性死亡较少。该病病程长,反复发生,难治愈,给养兔业带来了严重的的经济损失。Bb的菌毛蛋白兼具毒力因子及免疫原的特性,其免疫原性已被证实。对fimN基因进行克隆表达和免疫原性分析,以重组蛋白为检测抗原建立间接ELISA诊断方法,为兔波氏杆菌临床快速检测和研制高效疫苗奠定良好的基础。本研究一共分为四部分内容,第一部分采用PCR技术扩增并克隆兔支气管败血波氏杆菌的fimN基因；第二部分以大肠杆菌原核pET-28a（+）为表达系统进行fimN基因的表达、纯化及表达蛋白免疫原性分析；第三部分是兔支气管败血波氏杆菌PCR检测方法的建立；第四部分是兔支气管败血波氏杆菌间接ELISA诊断方法的建立。根据兔支气管败血波氏杆菌菌毛蛋白的fimN基因序列,设计一对特异性引物,扩增出648bp的目的基因片段,将产物与pMD-19T载体连接,阳性质粒经双酶切和测序鉴定,结果表明,扩增的fimN基因与参考序列同源性可高达99%,成功构建了克隆载体。对pMD19T-fimN以及表达载体pET-28a（+）双酶切,连接转化后,获得重组质粒pETBb-fimN,双酶切和序列鉴定结果表明目的基因的插入位置和方向正确,加入IPTG诱导后经SDS-PAGE检测得到的目的蛋白大小约为27KD, Western blot检测结果显示,表达的蛋白能与Bb全菌阳性血清发生特异性结合,为后续的以重组fimN蛋白为包被抗原来建立间接ELISA快速诊断方法奠定基础。根据GenBank中支气管败血波氏杆菌fimN基因的短片段序列设计了一对特反应,且检出最低浓度为10pg,说明该方法敏感性高,特异性强,可用于临床检测。以表达并纯化的fimN蛋白为包被抗原,用fimN蛋白免疫实验兔制备血清作为阳性血清。优化反应条件,确定抗原和血清的最佳工作浓度,最佳封闭液、酶标二抗和血清的最佳作用时间,得出了阴性血清临界值为0.267,敏感性和特异性试验表明,该方法特异性强,敏感性高,用建立的间接ELISA方法检测随机采集的50份兔血清,结果显示阳性率为58%。该方法的建立为Bb血清学检测提供了新途径。

论文目录

• 摘要
• ABSTRACT
• 目录
• 符号说明
• 文献综述
• 1 支气管波氏杆菌的研究概况
• 1.1 形态和培养特性
• 1.2 抗原
• 1.3 毒素
• 1.3.1 腺苷环化酶溶血素
• 1.3.2 皮肤坏死毒素或不耐热毒素
• 1.3.3 气管细胞毒素
• 1.4 其它生物学特性
• 1.4.1 丝状血凝素
• 1.4.2 百日咳杆菌黏附素
• 1.4.3 菌毛
• 1.4.4 Ⅲ型分泌系统（type-Ⅲ secretion system）
• 2 支气管波氏杆菌病的研究现状
• 2.1 支气管败血波氏杆菌病的流行性病学
• 2.2 支气管败血波氏杆菌病的临床症状及病理变化
• 2.3 支气管败血波氏杆菌病的防治措施
• 3 支气管败血波氏杆菌病诊断方法的研究
• 3.1 普通细菌学检测方法
• 3.2 血清学诊断方法
• 3.3 聚合酶链式反应（PCR）检测方法
• 3.4 16SrRNA测序
• 4 支气管波氏杆菌菌毛蛋白研究进展
• 第一章 兔支气管败血波氏杆菌FIMN基因的克隆
• 1 材料
• 1.1 菌种和质料
• 1.2 主要试剂
• 2 方法
• 2.1 fimN基因的扩增与克隆
• 2.1.1 Bb基因组DNA的提取
• 2.1.2 fimN引物设计和合成
• 2.1.3 PCR反应扩增体系
• 2.1.4 PCR产物的纯化
• 2.2 目的基因的克隆
• 2.2.1 产物与T载体连接
• 2.2.2 感受态细胞制备
• 2.2.3 转化
• 2.3 重组质粒的提取与鉴定
• 2.3.1 小量提取质粒（碱裂解法）
• 2.3.2 重组质粒的鉴定
• 3 结果
• 3.1 fimN基因的扩增
• 3.2 fimN在T载体中的克隆及鉴定
• 3.2.1 PCR法鉴定
• 3.2.2 重组质粒酶切鉴定
• 3.2.3 目的基因的序列分析
• 4 讨论
• 第二章 FIMN基因的表达及免疫原性分析
• 1 材判
• 1.1 质粒和菌种
• 1.2 主要试剂
• 2 方法
• 2.1 fimN基因原核表达载体的构建
• 2.1.1 重组质粒DNA的双酶切处理及产物的回收
• 2.1.2 连接反应
• 2.1.3 连接产物转化
• 2.1.4 重组质粒的提取及鉴定
• 2.2 fimN基因的诱导表达及条件优化
• 2.2.1 重组质粒pET28a-fimN转化
• 2.2.2 重组质粒在大肠杆菌中的表达
• 2.2.3 IPTG诱导培养时间的优化
• 2.3 表达蛋白的纯化
• 2.3.1 包涵体的获取与裂解
• 2.3.2 重组表达蛋白的纯化
• 2.4 重组表达蛋白的免疫原性分析
• 3 结果
• 3.1 fimN的原核表达载体的构建
• 3.2 fimN基因的表达及条件优化
• 3.2.1 fimN基因的表达
• 3.2.2 表达时间优化
• 3.3 重组表达蛋白的纯化
• 3.4 重组表达蛋白的免疫原性分析
• 4 讨论
• 第三章 支气管败血波氏杆菌PCR检测方法的建立
• 1 材料
• 1.1 菌种
• 1.2 主要试剂
• 2 方法
• 2.1 引物设计与合成
• 2.2 模板DNA的制备
• 2.3 PCR反应体系
• 2.4 PCR反应条件优化
• 2.4.1 最佳退火温度
• 2浓度梯度'>2.4.2 MgCl₂浓度梯度
• 2.4.3 引物最佳浓度
• 2.5 PCR敏感性试验
• 2.6 PCR特异性试验
• 2.7 PCR扩增产物的克隆及目的片段的序列分析
• 2.8 分离株的检测
• 3 结果
• 3.1 PCR扩增
• 3.2 PCR反应条件优化
• 3.3 PCR敏感性试验
• 3.4 PCR特异性试验
• 3.5 PCR扩增产物的克隆及目的片段的序列分析
• 3.6 PCR法检测分离株
• 4 讨论
• 第四章 支气管败血波氏杆菌间接ELISA诊断方法建立
• 1 材料
• 1.1 抗原
• 1.2 血清
• 1.3 主要试剂
• 2 方法
• 2.1 阳性血清的制备
• 2.2 ELISA最佳反应条件的选择
• 2.2.1 抗原包被最佳浓度和阳性血清最适浓度的选择
• 2.2.2 最佳封闭液的确定
• 2.2.3 封闭时间的确定
• 2.2.4 阴阳性血清最佳反应时间的确定
• 2.2.5 酶标抗体作用时间的选择
• 2.2.6 ELISA结果判定
• 2.3 敏感性试验
• 2.4 交叉反应试验
• 2.5 阻断试验
• 2.6 重复性试验
• 2.7 ELISA方法的应用
• 3 结果
• 3.1 抗原包被最佳浓度和阳性血清最适浓度的选择
• 3.2 最佳封闭液的确定
• 3.3 最佳封闭时间
• 3.4 阴阳性血清最佳反应时间的确定
• 3.5 酶标抗体最佳作用时间的选择
• 3.6 ELISA结果判定
• 3.7 敏感性试验
• 3.8 交叉反应试验
• 3.9 阻断试验
• 3.10 重复性试验
• 3.11 ELISA方法的应用
• 4 讨论
• 结论
• 参考文献
• 附录 常用缓冲液及溶液配制
• 致谢
• 攻读学位期间取得的研究成果