太行黑山羊FGF5基因CDs区的克隆、序列特征及其表达规律研究

论文摘要

太行黑山羊属于地方山羊品种,被毛为混型毛,毛色黑亮,所产紫绒纤维细长,受人工选择的影响较低,品种特征比较明显。本试验应用反转录RT-PCR从太行黑山羊皮肤组织中克隆了成纤维细胞生长因子5（FGF5）基因CDs区全序列,对其进行生物信息学分析;同时应用实时定量PCR技术对FGF5基因在太行黑山羊毛囊生长发育不同时期的表达规律进行研究。研究结果如下:1.太行黑山羊FGF5基因CDs区全序列长度为813 bp,编码270个氨基酸,其中包含一个FGF结构域（87～221个氨基酸）;太行黑山羊FGF5基因CDs区核苷酸序列与牛（NM001078011）、马（XM001492556）、人（NM004464.3）、猩猩（XM526572.2）和小鼠（NM010203.4）的同源性分别为98%,92%,90%,90%和86%。其氨基酸序列与牛、马、人、猩猩和小鼠的同源性分别为98%,91%,91%,91%和91%;太行黑山羊的FGF5基因编码的氨基酸高度保守;2.太行黑山羊FGF5基因编码的蛋白质氨基酸组成中,相对含量比较多的氨基酸是Ser、Gly、Lys、Leu、Ala和Pro,预测蛋白质相对分子量（MW）为29540.7Da,理论等电点（pI）为10.67;带负电荷残基总数（Asp + Glu）为15,带正电荷残基总数（Arg + Lys）为43;分子式为C1312H2081N391O376S6,总原子数为4166,半衰期约为30h,不稳定性指数为57.50,脂肪族氨基酸指数为63.26;该蛋白质亲水性最大值为3.067,最大疏水峰值为-2.789;为分泌蛋白,含有2个跨膜结构。蛋白质磷酸化位点分析可知,FGF5蛋白有25个Ser,2个Thr,3个Tyr,可能成为蛋白激酶磷酸化的位点;信号肽预测分析表明,该蛋白质N端的1～21个氨基酸为一经典的信号肽序列;3.在检测的四个月份的皮肤组织中,FGF5基因的相对表达量分别为7月（0.019906±0.003a）、8月（0.015713±0.001a）、9月（0.028374±0.001b）、10月（0.019466±0.002a）,可见,该基因在所检测的四个不同月份中均有表达,推测太行黑山羊FGF5可能是以一种连续的表达模式发挥着调节作用。统计分析表明:FGF5基因于9月份表达量显著高于7、8、10月份（P<0.05）,而7、8、10三个月份之间无明显差异（P>0.05）。推测太行黑山羊毛囊发育在7、8月份处于生长期,9月由生长期向退行期过渡,10月份进入退行期。

论文目录

• 摘要
• ABSTRACT
• 第一章 文献综述
• 1.1 太行黑山羊及其研究现状
• 1.1.1 太行黑山羊品种特征
• 1.1.2 太行黑山羊研究现状
• 1.2 毛囊发育与被毛生长的周期性变化
• 1.2.1 毛囊的基本结构
• 1.2.2 毛囊的发生、类型及特点
• 1.2.3 毛囊的循环再生
• 1.2.4 毛囊循环再生的分子机制
• 1.3 成纤维细胞生长因子研究进展
• 1.3.1 成纤维细胞生长因子简介
• 1.3.2 成纤维细胞生长因子5（FGF5）基因的研究进展
• 1.4 实时荧光定量PCR 技术
• 1.4.1 实时荧光定量PCR 技术的基本原理
• 1.4.2 实时荧光定量PCR 技术的应用
• 1.5 本研究的目的与意义
• 1.6 本研究的技术路线
• 第二章 FGF5 基因CDs 区的克隆与分析
• 2.1 试验材料
• 2.1.1 样品采集
• 2.1.2 主要仪器设备
• 2.1.3 主要试剂
• 2.1.4 常用试剂、缓冲液及培养基配制
• 2.1.5 载体、酶、试剂盒
• 2.2 试验方法
• 2.2.1 总RNA 的提取
• 2.2.2 引物的设计与合成
• 2.2.3 RT-PCR 反应
• 2.2.4 PCR 产物的回收和纯化
• 2.2.5 PEMG-T Easy 载体的连接反应
• 2.2.6 大肠杆菌感受态细胞的制备
• 2.2.7 连接产物的转化
• 2.2.8 阳性克隆的筛选
• 2.2.9 质粒提取
• 2.2.10 重组质粒酶切鉴定
• 2.3 生物信息学分析
• 2.3.1 基因序列测定
• 2.3.2 序列同源性分析
• 2.3.3 蛋白质理化性质的分析
• 2.3.4 蛋白质亲疏水性分析
• 2.3.5 跨膜区结构预测
• 2.3.6 信号肽预测
• 2.4 试验结果
• 2.4.1 总RNA 质量检测
• 2.4.2 RT-PCR 扩增结果
• 2.4.3 酶切鉴定结果
• 2.4.4 PCR 测序
• 2.5 目的基因克隆序列的遗传及生物信息学分析
• 2.5.1 太行黑山羊FGF5 基因核苷酸序列分析
• 2.5.2 太行黑山羊FGF5 基因氨基酸序列分析
• 2.5.3 太行黑山羊FGF5 基因CDs 区序列的同源性分析
• 2.5.4 太行黑山羊及其它5 个哺乳动物FGF5 氨基酸序列的系统发育树分析
• 2.5.5 太行黑山羊FGF5 的蛋白质信息分析
• 2.5.6 太行黑山羊FGF5 蛋白功能结构域分析
• 2.5.7 太行黑山羊FGF5 蛋白疏水性分析
• 2.5.8 太行黑山羊FGF5 基因编码蛋白质跨膜结构预测
• 2.5.9 蛋白质磷酸化位点分析
• 2.5.10 信号肽分析
• 2.6 讨论
• 2.6.1 关于候选基因的选择
• 2.6.2 关于FGF5 的序列特征及生物学功能
• 2.6.3 关于RNA 的提取
• 2.7 结论
• 第三章 太行黑山羊FGF5 基因在皮肤毛囊生长不同时期的表达量分析
• 3.1 试验材料
• 3.1.1 组织样采集
• 3.1.2 主要试剂
• 3.1.3 主要仪器设备
• 3.2 试验方法
• 3.2.1 总RNA 提取
• 3.2.2 总RNA 的纯化
• 3.2.3 反转录
• 3.2.4 反转录cDNA 检测
• 3.2.5 荧光定量PCR 引物
• 3.2.5 引物特异性检测
• 3.2.6 荧光定量检测
• 3.2.7 基因表达量计算及数据处理方法
• 3.3 试验结果与分析
• 3.3.1 太行黑山羊皮肤组织总RNA 提取及质量评估
• 3.3.2 反转录cDNA 检测结果
• 3.3.3 引物特异性及内参可靠性检测结果
• 3.3.4 染料法荧光定量检测结果
• 3.4 讨论
• 3.4.1 关于实验结果的分析
• 3.4.2 关于内参基因
• 3.4.3 采样的方法与技巧
• 3.4.4 创新点与不足
• 3.5 结论
• 第四章 结论
• 参考文献
• 附录
• 致谢
• 作者简介