论文摘要
海洋真菌次级代谢产物化学结构的多样性为寻找新的抗肿瘤先导化合物提供了重要资源。本文选取了从不同生源环境中分离得到的海洋真菌作为研究对象,开展抗肿瘤活性次级代谢产物的研究工作,研究主要内容包括:活性菌株筛选和发酵条件考察;代谢产物的分离纯化及结构鉴定;单体化合物的抗肿瘤活性初步评价;活性化合物的生物转化研究。从不同来源的海洋动物样品中分离纯化海洋微生物90株,通过以活性筛选为主、化学筛选为辅的新二级组合筛选模式,共筛选出活性真菌15株。经过发酵条件考察,最终确定根霉Rhizopus sp. 2-PDA-61和烟曲霉Aspergiilus fumigatus WFZ-25作为进一步化学研究的目标菌株。同时,我们还选取了一株来源于青岛胶州湾海泥、高产细胞松弛素的真菌曲丽穗霉Spicaria elegans KLA03作为生物转化研究的对象。经过大发酵,从根霉2-PDA-61和烟曲霉WFZ-25乙酸乙酯萃取物中共分离得到化合物70个,采用现代波谱学、化学方法并结合理化性质,确定了其中60个化合物的结构（1-60）,包括新化合物23个和一个新天然产物（43）。新化合物类型涉及到甾醇类化合物（1-6）、呋喃衍生物（12-18）、fumitremorgin类生物碱（30-37）和螺内酰胺类化合物（51-52）。新化合物1为首次从微生物中报道的14β-15-酮甾醇,化合物30-34为天然罕见的杂螺环fumitremorgin类生物碱。其它已知化合物分别为5个甾醇类化合物（7-11）、13个fumitremorgin类生物碱（38-50）、1个呋喃类衍生物（19）、1个螺内酰胺类化合物（53）、3个苯丙氨酸和丝氨酸衍生的生物碱（55-57）、3个喹唑啉类生物碱（58-60）、2个环五肽（20-21）、5个苯的衍生物（22-25, 54）、2个核苷（26-27）、1个脑苷脂（28）和1个甘油单酯（29）。此外,我们还推测了甾醇类化合物和fumitremorgin类生物碱（30-50）可能的生物合成途径。采用氨基酸前体添加的方式初步研究了细胞松弛素类化合物在曲丽穗霉KLA03中的生物转化,结果表明:a静置培养促进细胞松弛素类化合物的产生;b添加D-Trp明显地影响KLA03的代谢,代谢产物中分离得到6个细胞松弛素,其中包括3个新化合物（61-63）,共同的特征是具有6, 7-环氧结构,推测其原因可能是代谢过程中细胞色素P450氧化酶活性被提高;c D-Trp在KLA03中没有被直接利用,而是被降解并形成一系列吲哚衍生物（69-72）。本文首次报道了D-Trp在海洋真菌中的代谢并结合文献进一步推测了其在曲丽穗霉Spicaria elegans KLA03中可能的转化途径。以不同肿瘤细胞株为模型,用SRB法或MTT法对分离得到的46个单体化合物的抗肿瘤活性进行了初步评价,结果表明这些化合物对不同肿瘤细胞系表现出不同程度的增殖抑制活性。其中甾醇化合物1、3-4对P388、A549、HL-60和BEL-7402细胞以及环五肽20、21对P388细胞表现出较好的抗肿瘤活性;fumitremorgin类化合物33-35对MOLT-4、A549、HL-60和BEL-7402肿瘤细胞株表现出较好的抗肿瘤活性;细胞松弛素61和64对A549细胞显示较强的抗肿瘤活性（IC50分别为8.2和3.1μM）。进一步构效分析发现:α,β-不饱和-7-酮骨架的甾醇（1-5, 7）比过氧化麦角甾醇骨架的甾醇（6, 8-10）表现出更强的抗肿瘤活性;α,β-不饱和-7-酮骨架的甾醇中,15-OH的有无对活性的贡献显得非常重要;fumitremorgin类化合物33-35表现出较好的抗肿瘤活性,推测其可能是化合物33的支链上存在过氧结构,而34、35支链上连有羟基的缘故。总之,本文筛选获得15株海洋真菌活性菌株;阐明了三株海洋真菌中73个单体化合物的结构,其中包括26个新化合物和1个新天然产物。新化合物1为首次从微生物中报道的14β-15-酮甾醇,化合物30-34为天然罕见的杂螺环fumitremorgin类生物碱;推测了甾醇和fumitremorgin类化合物的生物合成途径;评价了46个单体化合物的抗肿瘤活性,发现了10个活性较强的化合物;首次报道了D-Trp在海洋真菌曲丽穗霉Spicaria elegans KLA03中的代谢并形成一系列的吲哚衍生物和促进6, 7-环氧结构细胞松弛素的形成;发现了通过静置培养方式可以促进KLA03中细胞松弛素类化合物的产生。上述研究结果丰富了海洋真菌资源库,为抗肿瘤药物的研究提供了新的化合物结构类型,为有目的的利用海洋真菌进行生物转化研究奠定了基础。