单核细胞增生李斯特氏菌胶体金免疫层析方法的建立

论文摘要

单核细胞增生李斯特氏菌（Listeria monocytogens, LM）是一种重要的食源性致病菌,世界卫生组织（WHO）将其列入重点检测的四大食源性致病菌之一。LM能引起人类和动物李斯特氏菌病。人和动物感染LM可引起单核细胞增多症、脑膜炎、败血症和流产,严重威胁人类健康和社会经济的发展,同时也造成巨大经济损失。因此,加强食品中LM检测工作,建立一种快速、简便的筛查方法具有重要的意义。本研究旨在建立一种简便的、特异性强的针对食品中LM的胶体金免疫试纸条检测方法。本研究分别用0.3%福尔马林灭活的LM菌体和超声波破碎的菌体碎片免疫日本大耳白兔制备多克隆抗体。获得的多克隆抗体效价均达300000,与金黄色葡萄球菌、阪崎肠杆菌、福氏志贺氏菌有交叉反应。多克隆抗体用辛酸-硫酸铵法和磁珠吸附法纯化后纯度明显提高。以酸溶碱沉法提取的LM鞭毛蛋白作为免疫原免疫Balb/c小鼠制备单克隆抗体。通过问接ELISA方法对Balb/c小鼠脾脏细胞和SP2/0骨髓瘤细胞的融合细胞培养上清进行检测,筛选到6株阳性融合细胞。但6株阳性融合细胞经过第一次亚克隆后转为阴性,最终没有筛选到能够稳定分泌单克隆抗体的融合细胞株。本研究用两株可配对的抗LM单克隆抗体,建立了特异性检测LM的胶体金免疫层析方法。抗LM单克隆抗体标记胶体金颗粒,醋酸纤维素膜上分别包被另一株抗LM单克隆抗体和驴抗鼠二抗作为检测线和控制线,组装成胶体金免疫层析试纸条。最终确定的生产工艺参数为：胶体金颗粒粒径为40 nm左右,抗LM单克隆抗体A标记量为20μg/（mL胶体金溶液）,标记时pH值为8.1,检测线上抗LM单克隆抗体B浓度为2.0 mg/mL,控制线上驴抗鼠二抗浓度为1.0 mg/mL。在此工艺条件下,对LM纯培养物的检测灵敏度为107CFU/mL。对Ⅰ和4b血清型的LM均可检测,与同属的绵羊李斯特氏菌及属外的大肠埃希菌、金黄色葡萄球菌、阪崎肠杆菌等菌无交叉反应。在实际食品样本添加LM,经李氏菌增菌液选择性增菌48 h后试纸条检测结果为阳性,并用OXA平板涂布计数验证结果正确。通过37℃加速保存实验,试纸条保质期可达15个月。本研究成功地研制出特异性检测LM胶体金免疫层析试纸条,该试纸条具有结果容易判定、特异性强、稳定性好、操作简单的优点,可满足基层单位大批量检测。

论文目录

• 摘要
• ABSTRACT
• 第一章 前言
• 1.1 LM的概述
• 1.1.1 LM的生物学特性
• 1.1.2 致病机理
• 1.1.3 LM流行情况
• 1.2 LM检测方法研究现状[7
• 1.2.1 传统检测方法
• 1.2.2 API Listeria快速反应板方法
• 1.2.3 显色培养基快速检测方法
• 1.2.4 免疫学检测方法
• 1.2.5 分子生物学检测方法
• 1.3 抗LM抗体研究进展
• 1.4 免疫胶体金技术的概述
• 1.4.1 胶体金的定义及特点
• 1.4.2 胶体金的制备
• 1.4.3 胶体金标记抗体
• 1.4.4 胶体金免疫技术的主要模式
• 1.4.5 胶体金免疫技术的应用
• 1.5 选题的目的和意义
• 第二章 LM多克隆及单克隆抗体的制备
• 2.1 材料与仪器
• 2.1.1 试剂与材料
• 2.1.2 实验仪器
• 2.1.3 主要试剂的配制
• 2.2 实验方法
• 2.2.1 免疫原的制备
• 2.2.2 多克隆抗体的制备
• 2.2.3 单克隆抗体的制备
• 2.3 结果
• 2.3.1 LM鞭毛蛋白提取结果
• 2.3.2 兔抗血清的效价
• 2.3.3 兔抗血清的特异性
• 2.3.4 兔抗血清的纯化
• 2.3.5 小鼠抗血清效价的测定
• 2.3.6 小鼠抗血清特异性判定
• 2.3.7 阳性融合细胞的测定
• 2.3.8 阳性融合细胞亚克隆的测定
• 2.4 讨论
• 2.4.1 多克隆抗体的制备
• 2.4.2 单克隆抗体的制备
• 2.5 小结
• 第三章 胶体金免疫层析方法的建立
• 3.1 材料与仪器
• 3.1.1 试剂与材料
• 3.2 实验方法
• 3.2.1 抗体配对实验（双抗夹心ELISA方法）
• 3.2.2 胶体金的制备
• 3.2.3 胶体金质量分析
• 3.2.4 金标抗体的制备
• 3.2.5 NC膜的处理
• 3.2.6 LM胶体金免疫试纸条的组装
• 3.2.7 多克隆与单克隆抗体的配对实验
• 3.2.8 LM胶体金免疫试纸条评价实验
• 3.2.9 食品样本检测
• 3.3 结果
• 3.3.1 抗体配对实验（ELISA方法）结果
• 3.3.2 胶体金质量分析结果
• 3.3.3 金标抗体的制备
• 3.3.4 NC膜的处理
• 3.3.5 LM胶体金免疫试纸条的组装
• 3.3.6 多克隆与单克隆抗体配对实验结果
• 3.3.7 LM胶体金免疫试纸条的评价
• 3.3.8 食品样本的检测
• 3.4 讨论
• 3.4.1 胶体金的制备
• 3.4.2 金标抗体的制备
• 3.4.3 LM胶体金免疫试纸条的特点
• 3.5 小结
• 第四章 结论与展望
• 4.1 结论
• 4.1.1 抗LM多克隆抗体的制备
• 4.1.2 胶体金免疫层析方法的建立
• 4.2 展望
• 4.2.1 LM抗体的制备
• 4.2.2 LM胶体金免疫试纸条的灵敏度
• 致谢
• 参考文献
• 个人介绍
• 攻读学位期间的研究成果