六价铬对大鼠肝细胞线粒体呼吸链电子漏的影响研究

论文摘要

目的：确定适用于线粒体功能活性试验研究的线粒体提取方法,并初步探索Cr（VI）诱导大鼠肝细胞线粒体呼吸链电子漏增加的机制,为阐明Cr（VI）诱导肝细胞氧化损伤的机制提供线索。方法：分别用蔗糖法和试剂盒法提取大鼠肝细胞线粒体,用OPTEC光学显微镜和H-600透射电子显微镜观察线粒体形态结构和超微结构。用960MC荧光分光光度计和Clark氧电极测定线粒体提取0.5h、1.5h和2.5h后的线粒体膜电位,ST3, ST4及呼吸控制率。用SP-756P可见分光光度计测定线粒体及其他亚细胞器特异性标志酶的酶比活性。分别以谷氨酸/苹果酸和琥珀酸为呼吸底物,启动线粒体主呼吸链和次呼吸链的电子传递。测定不同浓度的Cr（VI）对肝细胞线粒体呼吸链ROS生成量的影响。用Clark氧电极测定肝细胞线粒体主呼吸链和次呼吸链的基础呼吸速率。线粒体悬液用Cr（VI）, GSH和各种复合体抑制剂处理。其中,线粒体主呼吸链电子传递用Rot, DPI和Ant单独或联合处理,而线粒体次呼吸链电子传递用Rot, DPI, TTFA和Ant单独或联合处理。用VarioskanFlash 4.00.52多功能酶标仪分别测定各组线粒体主呼吸链和次呼吸链O2’-和ROS的生成量。结果：1.蔗糖法提取的线粒体膜电位和呼吸控制率显著高于试剂盒法,差异有统计学意义（P<0.05）。两种方法提取的线粒体标志酶的纯化倍数没有统计学差异（P>0.05）。两种方法提取的线粒体超微结构均完整,未见肿胀或损伤,但试剂盒法提取的线粒体纯度较差,可见大量泡状体。2Cr（VI）在0-100uM的浓度范围内,能诱导肝细胞线粒体主呼吸链和次呼吸链ROS的生成量随着Cr（VI）浓度的增加而增加,差异有统计学意义（P<0.05）。线粒体次呼吸链的基础呼吸速率大于主呼吸链的基础呼吸速率,差异有统计学意义（P<0.05）。3.以谷氨酸/苹果酸为呼吸底物时,与对照组相比,Rot组,Rot+Ant组和DPI+Ant组的ROS含量和电子漏增加,Rot+DPI组和Ant组ROS含量增加,DPI组的ROS含量降低（P<0.05）。与Cr（Ⅵ）组相比,Cr（Ⅵ）+Rot组,Cr（Ⅵ）+Ant组,Cr（Ⅵ）+Rot+DPI组,Cr（Ⅵ）+Rot+Ant组和Cr（Ⅵ）+DPI+Ant组的ROS含量和电子漏增加,Cr（VI）+DPI组ROS含量增加（P<0.05）。4.以琥珀酸为呼吸底物时,与对照组相比,Rot组,DPI组,Rot+DPI组,Rot+TTFA组和DPI+TTFA组ROS含量和电子漏降低,TTFA组,Ant组,Rot+Ant组,Rot+DPI组和TTFA+Ant组的ROS含量和电子漏增加,Rot+TTFA组的ROS含量降低（P<0.05）。与Cr（Ⅵ）组相比,Cr（Ⅵ）+Rot组,Cr（Ⅵ）+DPI组和Cr（Ⅵ）+Rot+DPI组的ROS含量没有统计学差异（P>0.05）。Cr（Ⅵ）+TTFA组和Cr（Ⅵ）+Rot+TTFA组,Cr（Ⅵ）+Ant组,Cr（Ⅵ）+Rot+Ant组Cr（Ⅵ）+DPI+Ant组和Cr（Ⅵ）+TTFA+Ant组ROS生成量和电子漏增加,Cr（Ⅵ）+DPI+TTFA组减少（P<0.05）。结论：1.蔗糖法提取的线粒体,与试剂盒法相比,线粒体膜功能和呼吸功能良好,纯度高,超微结构完整,能满足后续线粒体功能活性研究的需要。2.50uM Cr（Ⅵ）诱导肝细胞线粒体主呼吸链电子漏增加,主要从复合体Ⅰ和复合体Ⅲ的泛醌结合位点漏出。对于次呼吸链,50uMCr（Ⅵ）诱导肝细胞线粒体电子漏增加的机制是通过当电子沿着次呼吸链正向传递到复合体Ⅲ时,在复合体Ⅲ的泛醌结合位点漏出,电子漏增加,而导致线粒体氧化损伤。3.200uMGSH通过有效清除肝细胞线粒体内过量生成的H202,减少总ROS含量,对50uM Cr（Ⅵ）诱导肝细胞线粒体呼吸链电子漏增加所致的氧化损伤有显著的保护作用。

论文目录

• 中文摘要
• ABSTRACT
• 目录
• 英文缩略表
• 第一章 前言
• 第二章 材料与方法
• 2.1 试验材料
• 2.1.1 受试细胞
• 2.1.2 受试物
• 2.1.3 主要试剂
• 2.1.4 试验溶液配制
• 2.1.5 主要仪器
• 2.2 试验方法
• 2.2.1 肝细胞线粒体提取
• 2.2.2 肝细胞线粒体形态和超微结构观察
• 2.2.3 肝细胞线粒体蛋白浓度测定
• 2.2.4 肝细胞线粒体膜功能活性的测定
• 2.2.5 肝细胞线粒体呼吸功能测定
• 2.2.6 肝细胞线粒体纯度测定
• 2.2.7 肝细胞线粒体呼吸链基础呼吸速率的测定
• 2.2.8 ROS生成量的测定
• 2^·-含量的测定'>2.2.9 O₂^·-含量的测定
• 2.2.10 电子漏的计算
• 2.2.11 统计分析
• 第三章 实验结果
• 3.1 肝细胞线粒体提取质量评价
• 3.1.1 肝细胞线粒体的形态和超微结构观察
• 3.1.2 肝细胞线粒体膜电位
• 3.1.3 肝细胞线粒体呼吸功能
• 3.1.4 肝细胞线粒体的纯度测定结果
• 3.2 Cr（Ⅵ）对大鼠肝细胞线粒体呼吸链电子漏的影响
• 3.2.1 肝细胞线粒体主呼吸链和次呼吸链的基础呼吸速率
• 3.2.2 不同浓度的Cr（Ⅵ）对肝细胞线粒体呼吸链ROS生成的影响
• 3.2.3 Cr（Ⅵ）对肝细胞线粒体主呼吸链复合体Ⅰ电子漏的影响
• 3.2.4 Cr（Ⅵ）对肝细胞线粒体主呼吸链复合体Ⅲ电子漏的影响
• 3.2.5 以琥珀酸为底物,Cr（Ⅵ）对肝细胞线粒体次呼吸链电子回流的影响
• 3.2.6 Cr（Ⅵ）对肝细胞线粒体次呼吸链复合Ⅱ电子漏的影响
• 3.2.7 Cr（Ⅵ）对肝细胞线粒体次呼吸链复合体Ⅲ电子漏的影响
• 3.2.8 GSH对Cr（Ⅵ）诱导的肝细胞线粒体主呼吸链电子漏的干预
• 3.2.9 GSH对Cr（Ⅵ）诱导的肝细胞线粒体次呼吸链电子漏的干预
• 第四章 实验讨论
• 4.1 肝细胞线粒体提取质量评价
• 4.2 不同浓度的Cr（Ⅵ）对肝细胞线粒体呼吸链的影响
• 4.3 Cr（Ⅵ）对肝细胞线粒体主呼吸链电子漏的影响
• 4.4 Cr（Ⅵ）对肝细胞线粒体次呼吸链电子漏的影响
• 4.5 GSH对Cr（Ⅵ）诱导肝细胞线粒体呼吸链电子漏增加的保护作用
• 第五章 结论
• 参考文献
• 综述
• 参考文献
• 致谢
• 研究生期间的成绩