论文摘要
碘化N-正丁基氟哌啶醇（F2）是本实验室设计合成的一种新型的氟哌啶醇季铵盐衍生物,实验表明它对心肌缺血再灌注损伤以及心肌细胞、内皮细胞缺氧复氧损伤具有保护作用,这种作用与抑制早期生长反应基因-1（egr-1）mRNA及蛋白水平的过度表达有关。缺氧可以导致血管平滑肌细胞的过度增殖,进而导致一系列血管增生性疾病。本实验以体外培养的血管平滑肌细胞（VSMCs）为研究对象,观察F2对缺氧诱导的平滑肌细胞过度增殖的作用及其与Egr-1的关系。目的研究碘化N-正丁基氟哌啶醇（F2 ）对缺氧导致的血管平滑肌细胞增殖的影响,并探讨其作用机制是否与抑制egr-1高表达有关。方法1 Sprague-Dawley大鼠胸主动脉平滑肌细胞体外培养:采用组织块贴壁法。2 Sprague-Dawley大鼠胸主动脉平滑肌细胞鉴定:采用免疫组化法加以鉴定。3 Egr-1反义寡核苷酸在大鼠VSMCs中的转染。4实验分组:取3～5代VSMCs随机分为8组:对照组;缺氧组;F2组（1×10 - 6 mol/L）;聚乙二醇组（1×10 - 6 mol/L）;反义寡核苷酸组;正义寡核苷酸组;错义寡核苷酸组;脂质体组。除对照组外,其余各组均作缺氧模型。5取第3～5代培养的大鼠胸主动脉平滑肌细胞制作缺氧模型,应用噻唑蓝比色法（MTT）检测细胞增殖情况,流式细胞仪（FCM）观察分析VSMCs细胞周期分布特征的改变,蛋白印迹杂交方法（Western-blot方法）检测Egr-1及血小板衍生生长因子A（PDGF-A ）蛋白表达情况。结果1原代培养4～7天左右可见组织块周围有细胞长出,2～3周达亚融合,传代后细胞“峰、谷”状生长明显。2α- SM actin免疫组化染色阳性。3 FITC标记的反义寡核苷酸在488nm的激发光源下呈现绿色,荧光显微镜下可见细胞核及细胞浆中有绿色荧光,发出绿色荧光的位置与同一视野下细胞所在位置相一致,说明反义寡核苷酸成功转入平滑肌细胞。4缺氧诱导的血管平滑肌细胞中Egr-1蛋白的表达在缺氧1 h后明显升高,2 h达高峰,此后逐渐下降,直到20 h仍然高于相应的对照组。5与Control组相比,缺氧组、正义组、错义组、聚乙二醇组以及脂质体组的比色吸光度A值、细胞周期S+ G2 /M期比例、Egr-1及PDGF-A蛋白表达水平均明显增高,G0/ G1期比例明显下降;与缺氧组比较, F2组及反义组比色吸光度A值、细胞周期S+ G2 /M期比例、Egr-1及PDGF-A蛋白表达水平均明显降低,G0/ G1期比例明显升高。结论F2可通过抑制Egr-1蛋白高表达来抑制缺氧导致的VSMCs的过度增殖。
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