小分子重组免疫毒素GnRH-luffinS的制备及其靶向治疗肿瘤的实验研究

论文摘要

重组免疫毒素是由靶向区和细胞毒性区组成、可以识别并选择性杀伤特定细胞的融合蛋白,是一类重要的肿瘤靶向性治疗药物。靶向区为能与肿瘤细胞表面抗原特异结合的抗体、细胞因子或激素,毒性区为细菌毒素,如铜绿假单胞菌外毒素（PE）和白喉毒素（DT）,或植物毒素,如蓖麻毒素（RT）、美洲商陆抗病毒蛋白（PAP）和皂草素等。重组免疫毒素用于恶性肿瘤的导向治疗已取得很大成功,如以人IL-2为导向分子,以DT为毒性部分的免疫毒素制剂（商品名ONTKA）已获得美国FDA批准,用于治疗皮肤T细胞淋巴瘤（CTCL）,另有多种重组免疫毒素在临床试验研究中也显示出良好的抗肿瘤效果。尽管重组免疫毒素具有广阔的应用前景,但是在临床应用中仍面临许多挑战,如免疫原性强和穿透性差,解决方法之一就是构建小分子的重组免疫毒素。丝瓜毒素（luffin）LuffinP1和luffinS2是从丝瓜籽中分离到的两种只有5kDa和8kDa的小分子量I型核糖体失活蛋白（RIP）,具有N-糖苷酶活性,能特异性水解真核细胞核糖体28s rRNA 4324位的腺嘌呤,使真核细胞核糖体60s大亚基失活,从而抑制蛋白质合成,对兔网织红细胞裂解液的IC50分别为10-9和10-10M左右,可作为潜在的免疫毒素弹头分子。人Ⅰ型促性腺激素释放激素（ gonadotropin-releasing hormone, GnRH或luteinizing hormone-releasing hormone, LHRH）是下丘脑分泌的一种十肽类激素,用于调控脑垂体促黄体生成素（LH）和促卵泡激素（FSH）的分泌。GnRH受体通常分布于脑垂体、性腺的细胞膜上,但研究发现,GnRH受体也高表达于某些癌细胞表面,如乳腺癌、卵巢癌、子宫内膜癌、胰腺癌、前列腺癌及肝癌细胞等。因此GnRH和相关肽已经应用于妇科学和肿瘤学领域的研究,如用于性腺机能减退、不育症和性腺依赖性肿瘤的治疗。另外,肿瘤细胞表面的GnRH受体与GnRH有较高的亲和力,因此GnRH可以作为肿瘤靶向治疗中的导向分子。如制备的LHRH-PE40重组免疫毒素对人多种肿瘤细胞系有明显的杀伤作用,目前已进入临床试验阶段。因此,以GnRH为导向分子、以luffinP1或luffinS2为毒性部分构建的重组免疫毒素是一种潜在的免疫原性低、穿透力强的小分子抗肿瘤药物。本文首先克隆并原核表达了luffinP1和luffinS2蛋白,测定其蛋白合成抑制作用,筛选活性较高的蛋白作为重组免疫毒素的毒性部分;随后将GnRH与luffinS2进行基因融合,原核表达并纯化GnRH-luffinS2和luffinS2-GnRH融合毒素,测定其体外细胞毒作用;因为铜绿假单胞菌外毒素转膜区（PEⅡ区）具有蛋白酶识别位点和转膜功能,能提高重组免疫毒素的转膜效率,并能使重组免疫毒素的毒性部分和导向部分在胞内分离,从而提高重组免疫毒素的细胞毒作用,所以将其插入到GnRH和luffinS2之间,构建GnRH-PEⅡ-luffinS重组免疫毒素,表达纯化后测定其体内外抑肿瘤活性。具体的实验内容和结果如下:1. luffinP1和luffinS2全长基因的克隆、表达和活性研究（1）利用Codon软件,设计luffinP1和luffinS2的重叠PCR引物,通过对重叠PCR反应体系和条件的优化,扩增得到了luffinP1和luffinS2的全长基因。（2）luffinP1和luffinS2分别与表达载体pET-His、pET32a、pQE30和pBV220连接,构建pET-His/luffinP1、pET-His/luffinS2、pET32a/luffinP1、pET32a/luffinS2、pQE30/luffinP1、pQE30/luffinS2、pBV220/luffinP1和pBV220/luffinS2表达载体,转化宿主菌,并诱导表达。结果只有pET32a/luffinP1和pET32a/luffinS2转化BL21（DE3）大肠埃希杆菌后获得表达,且均为可溶性表达。经亲和层析纯化后,获得Trx-luffinP1和Trx-luffinS2融合蛋白。随后,利用重组肠激酶（rEK）将Trx-luffinP1和Trx-luffinS2融合蛋白切割,获得rluffinP1和rluffinS2。（3）测定rluffinP1和rluffinS2对兔网织红细胞裂解液的蛋白合成抑制作用。结果表明,rluffinP1和rluffinS2的IC50分别为9.51μg/ml和1.58μg/ml,因此选择luffinS2作为重组免疫毒素的毒性部分。2. GnRH-luffinS2和luffinS2-GnRH融合蛋白的克隆、表达和活性研究（1）因为无法确定GnRH和luffinS2的连接顺序对GnRH和luffinS2的活性是否有影响,因此设计了GnRH-luffinS2（GnRH在N端）和luffinS2-GnRH（GnRH在C端）融合蛋白,并对其二级进行预测。（2）利用Codon软件,设计了GnRH-luffinS2和luffinS2-GnRH的重叠PCR引物,通过对重叠PCR反应体系和条件的优化,扩增得到了GnRH-luffinS2和luffinS2-GnRH的全长基因。（3）GnRH-luffinS2和luffinS2-GnRH分别与pET-His、pET32a、pQE30和pBV220连接,构建pET-His/GnRH-luffinS2、pET-His/luffinS2-GnRH、pET32a/GnRH-luffinS2、pET32a/luffinS2-GnRH、pQE30/GnRH-luffinS2、pQE30/luffinS2-GnRH、pBV220/GnRH-luffinS2和pBV220/luffinS2-GnRH原核表达载体,转化宿主菌,并诱导表达。结果只有pET32a/GnRH-luffinS2和pET32a/luffinS2-GnRH转化BL21（DE3）后获得表达,且均为可溶性表达。经亲和层析纯化后,获得了Trx-GnRH-luffinS2和Trx-luffinS2-GnRH。随后,利用rEK将Trx-GnRH-luffinS2和Trx-luffinS2-GnRH融合蛋白切割,获得rGnRH-luffinS2和rluffinS2-GnRH。（4）采用XTT法测定rGnRH-luffinS2和rluffinS2-GnRH对体外肿瘤细胞Hela、A549、HepG-2、SP2/0和CEF细胞毒性作用。结果表明,rGnRH-luffinS2对上述细胞的IC50分别为67.19μg/ml、70.42μg/ml、84.44μg/ml和106.25μg/ml,rluffinS2-GnRH对上述细胞的IC50分别79.5μg/ml、76.7μg/ml、96.2μg/ml和137μg/ml,两种融合毒素对CEF均无毒性,表明rGnRH-luffinS2和rluffinS2-GnRH具有一定的抗肿瘤作用,但活性不高。3. GnRH-PEⅡ-luffinS2融合蛋白的克隆、表达和抗肿瘤活性研究（ 1 ）利用PEⅡ具有转膜区和蛋白酶识别位点的特性,设计GnRH-PEⅡ-luffinS重组毒素并对其二级进行预测。（2）利用Codon软件,设计了GnRH-PEⅡ-luffinS的重叠PCR引物,通过对重叠PCR反应体系和条件的优化,扩增得到了GnRH-PEⅡ-luffinS的全长基因。（3）选择pET32a为表达载体,构建pET32a/GnRH-PEⅡ-luffinS表达载体,转化BL21（DE3）大肠埃希杆菌后获得表达,蛋白以包涵体形式存在。经亲和层析纯化后,获得了Trx-GnRH-PEⅡ-luffinS融合蛋白,蛋白经透析复性和超滤浓缩后,利用rEK将Trx-GnRH-PEⅡ-luffinS融合蛋白切割为Trx和rGnRH-PEⅡ-luffinS。（4）采用XTT法测定rGnRH-PEⅡ-luffinS在体外对Hela、A549、HepG-2、SP2/0和CEF细胞毒性作用。结果表明,rGnRH-PEⅡ-luffinS对上述细胞的IC50分别为13.50μg/ml、13.74μg/ml、16.79μg/ml和26.07μg/ml,对CEF无作用,表明具有较强的抗肿瘤作用。（5）建立BALB/c小鼠的SP2/0实体瘤模型,检测rGnRH-PEⅡ-luffinS体内抗肿瘤活性。结果表明,剂量为100μg/只,瘤区内穿刺注射,连续10d给药时,rGnRH-PEⅡ-luffinS对SP2/0实体瘤的抑瘤率为50.3%,显示rGnRH-PEⅡ-luffinS具有一定的抗肿瘤作用。综上所述,本研究原核表达了luffinP1和luffinS2蛋白,利用兔网织红细胞裂解液证实luffinS2具有较高的蛋白合成抑制作用;然后构建了以GnRH为导向分子,以luffinS2为毒性分子的小分子重组免疫毒素GnRH-luffinS2和luffinS2-GnRH,体外对Hela、A549、HepG-2、SP2/0细胞毒实验表明,GnRH-luffinS2和luffinS2-GnRH的细胞毒性较低;为提高重组免疫毒素的细胞毒性,将PEⅡ插入到GnRH和luffinS之间,构建了GnRH-PEⅡ-luffinS重组免疫毒素。体外细胞毒实验表明,其细胞毒性获得明显提高,体内抑瘤实验表明,GnRH-PEⅡ-luffinS具有一定抗肿瘤活性,为进一步探讨其作为抗肿瘤药物的临床应用奠定了基础。

论文目录

• 缩略词表
• 中文摘要
• 英文摘要
• 前言
• 一、国内外研究现状
• 二、研究方法和思路
• 第一部分 luffin 原核表达质粒的构建、表达及活性检测
• 一、实验材料
• 二、实验方法
• 三、实验结果
• 第二部分 重组毒素 GnRH-luffinS2 的构建、表达及活性 检测
• 一、实验材料
• 二、实验方法
• 三、实验结果
• 第三部分 GnRH-PEⅡ-luffinS 的构建、表达及其活性检测
• 一、实验材料
• 二、实验方法
• 三、实验结果
• 讨论
• 1. 重组毒素的构建
• 2. 重组毒素的表达
• 3. 重组毒素包涵体的复性
• 4. 重组毒素的蛋白酶切割
• 5. 重组毒素的生物学活性
• 6. 荷瘤动物模型的建立与体内抑肿瘤实验
• 结论
• 参考文献
• 附录
• 文献综述：免疫毒素治疗肿瘤的研究进展
• 发表文章：小分子GnRH-luffinS 重组嵌合毒素的制备与其细胞毒性检测
• 个人简历
• 致谢