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菌根真菌Glomus mosseae中G.m14-3-3基因的研究

2020-12-16阅读(679)

菌根真菌Glomus mosseae中G.m14-3-3基因的研究

论文摘要

14-3-3蛋白广泛分布于所有真核生物中,该蛋白结构高度保守,存在于细胞内不同区域,参与调控细胞内各种生命代谢过程。本文根据已发表的Glomus mosseae14-3-3基因EST序列,利用反向PCR和3’RACE技术克隆到了Gm14-3-3基因的ORF全长,上游约2 kb长的启动子区和5’UTR以及基因的3’UTR序列；在菌根真菌中发现编码相同蛋白质的基因产生两种具有长短不同3’UTR转录产物的现象,并将两种转录产物分别命名为G.m14-3-3L和G.m14-3-3S。通过生物信息学的方法对G.m14-3-3基因以及其编码的蛋白质进行了分析,结果显示它与其它真核生物中的14-3-3蛋白具有较高的同源性,预测的3D模型具有典型的14-3-3蛋白的结构特征。通过构建以egfp为报告基因的表达载体,对G.m14-3-3基因的putative启动子在酿酒酵母Y187中进行了活性分析,.结果表明该基因启动子片段能在酵母中发挥功能。根据序列分析结果,在G.m14-3-3L的3’UTR和G.m14-3-3的ORF区段分别设计特异性引物,利用实时荧光定量RT-PCR技术探索了G.m14-3-3L和G.m14-3-3S在Glomus mosseae的休眠孢子和共生期间菌丝两个不同生长阶段,以及共生期间分别受到重金属Cu、Cd胁迫和盐胁迫时的转录变化,主要结果如下：1)在休眠期的孢子和共生期菌丝中,Gm14-3-3总的mRNA转录量基本相同,但Gm14-3-3L mRNA在休眠期孢子中的含量是共生期菌根根内菌丝含量的1.5倍；2)在200 mg/kg浓度的重金属铜胁迫下,Gml4-3-3总的mRNA含量随着时间的增加呈现出先降低,后恢复到CK水平的现象,并在24h处理时转录量下降到CK的1/2,期间G.m14-3-3L和G.m14-3-3S的比例无明显变化；3)在浓度为60 mg/kg的重金属镉胁迫时,各种时长处理表现出的变化较小,90 mg/kg的镉处理一个月,G.m14-3-3基因的转录量是CK的1.7倍；4)盐胁迫处理条件下,没有观察到该基因在转录水平有明显变化。据此推测G.m14-3-3基因的表达受转录水平和转录后水平的调控,并在菌根真菌的生命代谢活动和抵抗环境胁迫中起着重要作用。此外,通过构建原核表达载体成功实现了G.m14-3-3基因在大肠杆菌BL21（DE3）中的表达；通过在保守区段设计引物扩增到了实验室其余三个AM真菌Gigaspora margarita, Glomus intraradices, Gigaspora rosea中14-3-3基因的部分序列。本研究为后续研究菌根真菌中与14-3-3蛋白相关的信号通路以及利用14-3-3基因进行AM真菌菌种鉴定打下了基础。

论文目录

  • 摘要
  • Abstract
  • 缩略词表
  • 1 前言
  • 1.1 研究问题的由来
  • 1.2 文献综述
  • 1.2.1 菌根真菌共生机理简介
  • 1.2.2 菌根真菌分子生物学研究进展
  • 1.2.3 菌根真菌种属的分子生物学鉴定
  • 1.2.4 14-3-3蛋白介绍
  • 1.2.5 3'UTR对基因表达的影响
  • 1.2.6 基因全长克隆常用技术
  • 1.3 研究的目的及意义
  • 2 材料与方法
  • 2.1 实验材料和仪器
  • 2.1.1 生物材料
  • 2.1.2 试剂
  • 2.1.3 主要仪器设备
  • 2.2 实验方法
  • 2.2.1 G.m14-3-3基因全长的克隆
  • 2.2.2 基因启动子活性分析
  • 2.2.3 G.m14-3-3基因的原核表达
  • 2.2.4 G.m14-3-3基因的转录分析
  • 2.2.5 14.3-3基因在AM真菌鉴定中的初步应用
  • 3 结果与分析
  • 3.1 G.m14-3-3基因全序列克隆结果
  • 3.1.1 Glomus mosseae孢子基因组DNA的抽提结果
  • 3.1.2 反向PCR结果与分析
  • 3.1.3 3'RACE结果
  • 3.1.4 G.m14-3-3基因的生物信息学分析
  • 3.2 启动子分析结果
  • 3.2.1 表达载体构建结果
  • 3.2.2 启动子缺失结果分析
  • 3.3 G.m14-3-3基因在大肠杆菌BL21中的初步表达结果
  • 3.4 荧光定量PCR实验结果与分析
  • 3.4.1 G.m14-3-3基因在休眠孢子和根内菌丝中的转录区别
  • 3.4.2 G.m14-3-3基因在重金属和盐胁迫下的转录变化
  • 3.4.3 荧光定量PCR结果分析
  • 3.5 14-3-3基因在四种AM真菌种属中的扩增及种属区分应用
  • 3.5.1 以14-3-3基因为基础的探针引物设计结果
  • 3.5.2 Nest-PCR引物验证结果
  • 3.5.3 根据14-3-3基因对四种AM真菌的分类
  • 4 讨论
  • 4.1 菌根真菌基因全长的克隆
  • 4.2 菌根真菌基因功能在酵母中的验证
  • 4.3 G.m14-3-3基因的转录和转录后调控
  • 4.4 不同种属AM真菌中14-3-3基因的研究
  • 参考文献
  • 附录
  • 1 引物附表
  • 2 序列附表一
  • 3 序列附表二
  • 4 序列附表三
  • 5 序列附表四
  • 6 四种AMF 14-3-3基因部分序列比对结果
  • 7 载体构建流程图
  • 致谢

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