论文摘要
对于微生物学家来说,微生物群落及其在环境中活动的探测、鉴定和描述是一项很大的挑战。鉴于16s rDNA在分类学中的地位,现代分子生态学研究过程中选择了16S rDNA作为研究对象来标志生态系统中的微生物多样性。几种基于16S rDNA的技术已经广泛应用于微生物群落的描述,如RFLP、DGGE、TGGE等。几乎每种方法都能发现新的微生物种群,其中很多都是无法通过培养得到的。但是这些方法都会用到PCR扩增,其模板都是多种微生物的混合,从而引起PCR偏嗜和PCR虚假产物,进而导致对微生物群落结构多样性的错误估计。本文以八种已知细菌（Pseudomonas putida KT2440,Escherichia coli DH5α,Bacillus subtilis 168,Brevibacterium sp.,Agrobacterium sp.,Cellulosimicrobium sp.,Microbacterium sp.,和Rhodococcus sp.）组成的微生物群落模型为研究对象,阐明了多模板PCR扩增偏嗜性现象,同时,分析了DNA聚合酶、引物、循环数、退火温度、DNA提取效率、16S rDNA GC含量和DNA结构等对多模板PCR扩增偏嗜性的影响,最后,通过条件优化改善多模板PCR的扩增偏嗜性,进而分析八菌模型的微生物群落多样性。将八种细菌进行平板计数,按细胞数量等比例混合,提取其总DNA并构建16SrDNA克隆文库,挑取138个克隆进行RFLP分析,确定PCR产物的比例。结果显示了严重的偏嗜现象。其中P.putida KT2440被优先扩增,其酶切类型占47.1%。Brevibacterium sp.占34.8%,E.coli DH5α占5.8%,B.subtilis 168占1.4%,而其他四种菌几乎检测不到。将四种细菌即Agrobacterium sp.,Cellulosimicrobium sp.,Microbacterium sp.,Rhodococcus sp.按细胞数量等比例混合进行偏嗜性研究,结果显示Agrobacterium sp.占扩增的绝对优势,产物比例高达94.8%,Rhodococcus sp.只占2.6%,而Cellulosimicrobium sp.和Microbacterium sp.依然检测不到,可见其偏嗜性之严重。调整了四种细菌的比例作为模板来检测各菌的检出率,结果表明,当将Agrobacterium sp.,Rhodococcus sp.,Cellulosimicrobium sp.和Microbacterium sp.按细胞数量比例1:10:50:100混合时,四种细菌均能检出,其中模板中比例最少的Agrobacterium sp.扩增后产物所占比例最高,为40.9%。可以看出,用基于多模板PCR的分子生物学方法检测混合微生物的丰富度得到的信息能导致严重的误差。分析了循环数、DNA聚合酶、引物、退火温度、DNA提取效率、16S rDNA GC含量、DNA结构对多模板PCR扩增偏嗜性的影响。结果表明:随着循环数的减少,P.putida KT2440、Brevibacterium sp.和E.coli DH5α产物的比例趋于平衡,但其他五种细菌的出现存在很大的偶然性,与循环数并没有显著的关系;DNA聚合酶、引物和16S rDNA GC含量对偏嗜有一定的影响,但并不是主要因素:退火温度是影响由引物错配导致的偏嗜性的主要PCR参数;提取混合微生物的总DNA时虽然各种微生物的提取效率可能略有不同,但是各菌产物比例总体趋势与细胞数量等比混合构建的文库的产物比例趋势是一致的,因此不是造成本研究偏嗜性的主要原因;DNA结构对PCR扩增偏嗜的影响很大,通过Bsa29Ⅰ和HindⅢ+XbaⅠ完全酶切DNA,偏嗜有所改善,但是优势扩增种群发生变化,用Sau3AⅠ部分酶切DNA,DNA结构简化得比较均匀,各菌扩增较平衡,偏嗜性得到较好的改善。以八菌模型为研究对象,通过各方面条件优化,即将混合的总DNA用Sau3AⅠ部分酶切,回收2-4Kb片段作为模板,以27F和1492R为引物,45℃退火,运行20个循环进行PCR扩增,构建16S rDNA克隆文库,进行偏嗜性分析。结果显示:经过条件优化后,偏嗜性虽然依然存在,但是得到了较大程度的改善,为今后继续摸索减少多模板PCR扩增偏嗜性的条件奠定了基础。
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