论文摘要
纳豆激酶是从日本传统的大豆发酵食品——纳豆中发现的新型纤溶酶。这种酶具有较高的纤溶活性,无毒副作用,不引起内出血,在体内半衰期长。纳豆激酶无论作为抗血栓药物还是预防血栓栓塞性疾病的保健食品,都具有重要的开发价值。天然的纤溶酶活性往往较低,通过利用体外DNA分子改造等基因操作技术,构建高比活力的工程菌是实现产业化的重要途径。本研究主要进行了以下工作:(1)通过酪蛋白平板初筛和血纤维蛋白平板复筛结合的方法,从豆豉、纳豆样品中筛选到了21株纤溶酶产生菌,获得了一株高产纤溶酶菌株Na-002,纤溶酶活性可达10875U/g,比相关报道的出发菌株活性都要高。(2)通过形态鉴定、生理生化鉴定和16SrDNA序列分析等多项分类法,对Na-002进行了鉴定,确定其属于枯草芽孢杆菌。(3)通过PCR扩增技术,克隆获得了纤溶酶基因,与公布的11株纳豆激酶的核苷酸序列相似性达到99.8%99.2%,氨基酸序列相似性达到98.6%99.7%,说明该纤溶酶基因是纳豆激酶系列的一种,该基因的序列保守性强。(4)通过PCR技术克隆得到pro-NK基因,并分别构建pET-32a(+)表达载体、pWB980表达载体与pPIC9K表达载体,实现了在大肠杆菌BL21(DE3)、枯草芽孢杆菌WB800和毕赤酵母GS115中进行表达。实验表明,大肠杆菌表达的酶蛋白表达量高,易于纯化,但是多以包涵体形式存在,需要通过变性复性的方法才能获得有活性的酶;枯草芽孢杆菌表达活性最好,但是表达量少,纯化难度大;毕赤酵母表达系统的纯度高,但存在活性低,表达量相对较小的缺点。(5)通过定点突变的方法,从pH稳定性的角度对该酶基因进行了定点突变研究,获得了S182L、S182W、S182K、L203E、L203K等5个突变体,并实现了毕赤酵母表达。通过对该酶最适pH的测定发现,该酶最适pH的变化与碱基替换呈现出相关性:酸性氨基酸有利于酶在pH值为酸性范围内稳定,而碱性氨基酸有利于酶在pH值为碱性范围内稳定。(6)通过同源建模,推测该酶具有两个结构域:结合结构域(CBM)和催化结构域(CD)。CBM是结合在底物表面的,位于N端,用1scjB(同源性97.183%)作为模板,构建CBM的三维结构,它是由第7个氨基酸到第77个氨基酸共71个氨基酸构成,形成了两个α螺旋和3个β折叠;CD的三维结构用1scjA (同源性98.545%)作为模板来构建,由第78个氨基酸到第352个氨基酸共275个氨基酸构成,形成了一个(β/α)7桶状结构。本研究丰富了纳豆激酶的酶学基础理论知识,并为进一步的基因水平酶分子进化理论的研究以及口服溶栓药物的开发和应用奠定了基础。
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中文摘要Abstract1 前言1.1 血栓的形成机理1.2 抗凝疗法1.2.1 直接凝血酶抑制剂1.2.2 肝素1.2.3 类肝素1.2.4 水蛭素和重组水蛭素1.2.5 香豆素类药1.2.6 其他抗凝药物1.3 溶栓疗法1.3.1 纤溶系统1.3.2 溶栓药物的研究进展1.4 纳豆激酶研究进展1.4.1 纳豆激酶的酶学性质1.4.2 纳豆激酶的溶栓特性1.4.3 纳豆激酶的溶栓作用机制1.4.4 纳豆激酶基因克隆与表达1.4.5 纳豆激酶的活性检测方法1.5 酶的分子改造1.5.1 酶分子改造的研究方法1.5.2 分子改造技术的应用1.5.3 酶的分子改造1.6 同源建模1.6.1 同源建模原理及步骤1.6.2 同源建模的应用1.7 选题的目的意义、研究内容、技术路线1.7.1 选题的目的意义1.7.2 研究内容1.7.3 技术路线2 材料与方法2.1 实验材料2.1.1 分离菌株样品来源2.1.2 菌株与载体2.1.3 主要试剂2.1.4 主要仪器设备2.1.5 实验所用溶液及其配制3. 实验方法3.1 纤溶酶产生菌的分离和筛选3.2 菌种鉴定3.2.1 生理生化实验3.2.2 分子鉴定3.3 酶活性测定3.3.1 纤维蛋白原平板的配制3.3.2 尿激酶标准曲线的制作3.3.3 酶活检测3.4 pro-NK 基因的克隆测序与分析3.4.1 枯草杆菌DNA 的提取3.4.2 纳豆激酶基因的PCR 扩增3.4.3 电泳检测3.4.4 目的核苷酸片段克隆测序3.4.5 pro-NK 基因在BL21(DE3)中的表达3.4.6 pro-NK 基因在枯草杆菌WB800 中的表达3.4.7 pro-NK 基因在毕赤酵母GS115 中的表达3.4.8 纳豆激酶的定点突变与同源建模3.4.9 同源建模4 结果与讨论4.1 尿激酶活性标准曲线4.2 菌种筛选4.3 菌种鉴定4.3.1 菌株形态观察4.3.2 生理生化鉴定4.3.3 分子鉴定4.4 菌株Na-002 的生长曲线4.5 枯草杆菌纤溶酶基因的克隆测序与分析4.6 pET32a-pro-NK 载体的构建与pro-NK 基因的表达4.7 pET-32a-pro-NK 包涵体蛋白复性后的酶活测定4.7.1 纳豆激酶的变性和复性4.8 枯草杆菌表达载体pWB980-pro-NK 的构建与表达4.9 枯草芽孢杆菌纤溶酶在毕赤酵母中的表达4.9.1 纳豆芽孢杆菌纳豆激酶基因编码序列的克隆4.9.2 酵母表达载体的构建和鉴定4.9.3 线性化质粒DNA 的制备4.9.4 毕赤酵母转化4.9.5 酵母转化子的菌落PCR 筛选和鉴定(如图3-21 所示4.9.6 酵母工程菌的培养和纳豆激酶的诱导分泌表达4.10 纳豆激酶的定点突变与同源建模4.10.1 纳豆激酶的定点突变4.10.2 同源建模5 总结5.1 结论5.2 建议参考文献致谢攻读学位期间发表论文情况
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标签:枯草芽孢杆菌论文; 纳豆激酶论文; 克隆论文; 表达论文; 定点突变论文;
枯草芽孢杆菌Na-002纳豆激酶基因的克隆、表达及定点突变研究
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