枯草芽孢杆菌Na-002纳豆激酶基因的克隆、表达及定点突变研究

论文摘要

纳豆激酶是从日本传统的大豆发酵食品——纳豆中发现的新型纤溶酶。这种酶具有较高的纤溶活性，无毒副作用，不引起内出血，在体内半衰期长。纳豆激酶无论作为抗血栓药物还是预防血栓栓塞性疾病的保健食品，都具有重要的开发价值。天然的纤溶酶活性往往较低，通过利用体外DNA分子改造等基因操作技术，构建高比活力的工程菌是实现产业化的重要途径。本研究主要进行了以下工作：（1）通过酪蛋白平板初筛和血纤维蛋白平板复筛结合的方法，从豆豉、纳豆样品中筛选到了21株纤溶酶产生菌，获得了一株高产纤溶酶菌株Na-002，纤溶酶活性可达10875U/g，比相关报道的出发菌株活性都要高。（2）通过形态鉴定、生理生化鉴定和16SrDNA序列分析等多项分类法，对Na-002进行了鉴定，确定其属于枯草芽孢杆菌。（3）通过PCR扩增技术，克隆获得了纤溶酶基因，与公布的11株纳豆激酶的核苷酸序列相似性达到99.8%99.2%，氨基酸序列相似性达到98.6%99.7%，说明该纤溶酶基因是纳豆激酶系列的一种，该基因的序列保守性强。（4）通过PCR技术克隆得到pro-NK基因，并分别构建pET-32a（+）表达载体、pWB980表达载体与pPIC9K表达载体，实现了在大肠杆菌BL21（DE3）、枯草芽孢杆菌WB800和毕赤酵母GS115中进行表达。实验表明，大肠杆菌表达的酶蛋白表达量高，易于纯化，但是多以包涵体形式存在，需要通过变性复性的方法才能获得有活性的酶；枯草芽孢杆菌表达活性最好，但是表达量少，纯化难度大；毕赤酵母表达系统的纯度高，但存在活性低，表达量相对较小的缺点。（5）通过定点突变的方法，从pH稳定性的角度对该酶基因进行了定点突变研究，获得了S182L、S182W、S182K、L203E、L203K等5个突变体，并实现了毕赤酵母表达。通过对该酶最适pH的测定发现，该酶最适pH的变化与碱基替换呈现出相关性：酸性氨基酸有利于酶在pH值为酸性范围内稳定，而碱性氨基酸有利于酶在pH值为碱性范围内稳定。（6）通过同源建模，推测该酶具有两个结构域：结合结构域（CBM）和催化结构域（CD）。CBM是结合在底物表面的，位于N端，用1scjB（同源性97.183%）作为模板，构建CBM的三维结构，它是由第7个氨基酸到第77个氨基酸共71个氨基酸构成，形成了两个α螺旋和3个β折叠；CD的三维结构用1scjA （同源性98.545%）作为模板来构建,由第78个氨基酸到第352个氨基酸共275个氨基酸构成，形成了一个（β/α）7桶状结构。本研究丰富了纳豆激酶的酶学基础理论知识，并为进一步的基因水平酶分子进化理论的研究以及口服溶栓药物的开发和应用奠定了基础。

论文目录

• 中文摘要
• Abstract
• 1 前言
• 1.1 血栓的形成机理
• 1.2 抗凝疗法
• 1.2.1 直接凝血酶抑制剂
• 1.2.2 肝素
• 1.2.3 类肝素
• 1.2.4 水蛭素和重组水蛭素
• 1.2.5 香豆素类药
• 1.2.6 其他抗凝药物
• 1.3 溶栓疗法
• 1.3.1 纤溶系统
• 1.3.2 溶栓药物的研究进展
• 1.4 纳豆激酶研究进展
• 1.4.1 纳豆激酶的酶学性质
• 1.4.2 纳豆激酶的溶栓特性
• 1.4.3 纳豆激酶的溶栓作用机制
• 1.4.4 纳豆激酶基因克隆与表达
• 1.4.5 纳豆激酶的活性检测方法
• 1.5 酶的分子改造
• 1.5.1 酶分子改造的研究方法
• 1.5.2 分子改造技术的应用
• 1.5.3 酶的分子改造
• 1.6 同源建模
• 1.6.1 同源建模原理及步骤
• 1.6.2 同源建模的应用
• 1.7 选题的目的意义、研究内容、技术路线
• 1.7.1 选题的目的意义
• 1.7.2 研究内容
• 1.7.3 技术路线
• 2 材料与方法
• 2.1 实验材料
• 2.1.1 分离菌株样品来源
• 2.1.2 菌株与载体
• 2.1.3 主要试剂
• 2.1.4 主要仪器设备
• 2.1.5 实验所用溶液及其配制
• 3. 实验方法
• 3.1 纤溶酶产生菌的分离和筛选
• 3.2 菌种鉴定
• 3.2.1 生理生化实验
• 3.2.2 分子鉴定
• 3.3 酶活性测定
• 3.3.1 纤维蛋白原平板的配制
• 3.3.2 尿激酶标准曲线的制作
• 3.3.3 酶活检测
• 3.4 pro-NK 基因的克隆测序与分析
• 3.4.1 枯草杆菌DNA 的提取
• 3.4.2 纳豆激酶基因的PCR 扩增
• 3.4.3 电泳检测
• 3.4.4 目的核苷酸片段克隆测序
• 3.4.5 pro-NK 基因在BL21（DE3）中的表达
• 3.4.6 pro-NK 基因在枯草杆菌WB800 中的表达
• 3.4.7 pro-NK 基因在毕赤酵母GS115 中的表达
• 3.4.8 纳豆激酶的定点突变与同源建模
• 3.4.9 同源建模
• 4 结果与讨论
• 4.1 尿激酶活性标准曲线
• 4.2 菌种筛选
• 4.3 菌种鉴定
• 4.3.1 菌株形态观察
• 4.3.2 生理生化鉴定
• 4.3.3 分子鉴定
• 4.4 菌株Na-002 的生长曲线
• 4.5 枯草杆菌纤溶酶基因的克隆测序与分析
• 4.6 pET32a-pro-NK 载体的构建与pro-NK 基因的表达
• 4.7 pET-32a-pro-NK 包涵体蛋白复性后的酶活测定
• 4.7.1 纳豆激酶的变性和复性
• 4.8 枯草杆菌表达载体pWB980-pro-NK 的构建与表达
• 4.9 枯草芽孢杆菌纤溶酶在毕赤酵母中的表达
• 4.9.1 纳豆芽孢杆菌纳豆激酶基因编码序列的克隆
• 4.9.2 酵母表达载体的构建和鉴定
• 4.9.3 线性化质粒DNA 的制备
• 4.9.4 毕赤酵母转化
• 4.9.5 酵母转化子的菌落PCR 筛选和鉴定(如图3-21 所示
• 4.9.6 酵母工程菌的培养和纳豆激酶的诱导分泌表达
• 4.10 纳豆激酶的定点突变与同源建模
• 4.10.1 纳豆激酶的定点突变
• 4.10.2 同源建模
• 5 总结
• 5.1 结论
• 5.2 建议
• 参考文献
• 致谢
• 攻读学位期间发表论文情况