泰乐菌素和替米考星单克隆抗体制备及ELISA检测试剂盒研究

论文摘要

泰乐菌素和替米考星为动物专用抗生素,在兽医临床上广泛用于治疗畜禽支原体和革兰氏阳性细菌所致的感染性疾病。在畜牧生产上,泰乐菌素还用作饲料添加剂,促进动物生长。近年来,金黄葡萄球菌、肺炎球菌、流感嗜血杆菌对β-内酰胺类抗生素耐药性逐年上升,以及对大环内酯类药物敏感的支原体、衣原体感染病例逐渐增多,增加了大环内酯类药物在人医上的用量。但大环内酯类抗生素易诱导耐药性,且该类药物间存在交叉耐药性。鉴于此,欧盟在1999年禁止将动物专用的泰乐菌素用作饲料添加剂。泰乐菌素和替米考星是大环内酯类抗生素在畜牧兽医上应用最多的药物,在用于畜牧兽医的抗生素中占有重要的地位。在实际应用中,随意加大使用剂量和不遵守休药期必然会造成泰乐菌素和替米考星残留,其残留对消费者可产生毒性作用,如对超敏个体的过敏反应。我国对泰乐菌素和替米考星在组织中残留也制定了最高残留限量（MRL）。为了控制其残留,保障人类健康,有必要建立一种快速、有效的残留检测方法对其残留进行监测。现有的泰乐菌素和替米考星残留检测的方法主要为高效液相色谱（HPLC）分离,紫外和质谱检测的仪器方法。虽然仪器方法在鉴定药物种类和定量分析上表现出良好的性能,但由于其操作复杂、分析费用昂贵,而不适用于对大量样品进行残留筛选。酶联免疫吸附分析（ELISA）已经成为兽药残留筛选最重要的方法之一,为了控制泰乐菌素和替米考星残留,可以建立ELISA方法对其进行残留快速筛选。目前仅有泰乐菌素ELISA试剂盒,其它能同时检测泰乐菌素和替米考星残留的ELISA方法也很不完善,因此开发一种能同时检测泰乐菌素和替米考星残留的ELISA试剂盒,对其残留筛选具有重要价值。本实验以酒石酸泰乐菌素为原料,在酸性条件下水解制备去碳霉糖泰乐菌素（Desmycosin,DES）和5-O-碳霉糖胺泰乐内酯（5-O-Mycaminosyltylonolide,OMT）,并采用柱层析纯化。产物通过紫外、红外、质谱鉴定,表明两种化合物合成成功;采用HPLC法测定其相对含量,DES、OMT的含量分别为95.0%、97.6%。以DES和OMT为半抗原,采用O-羧甲基羟胺（AOAA）、己二酰二肼（ADH）、对肼基苯甲酸（HBA）作为交联臂,以牛血清白蛋白（BSA）和卵清蛋白（OVA）为载体合成了免疫原和包被原。偶联物用紫外扫描分析鉴定,结果显示,载体蛋白在交联半抗原前后其吸收光谱发生明显改变,表明人工抗原合成成功。人工抗原冷冻干燥后置-20℃保存,并对冻干保存的DES-AOAA-BSA以结合比考察了其化学稳定性,在已经保存的8个月内,结合比无变化,表明DES-AOAA-BSA冻干后能在-20℃稳定保存。以DES-AOAA-BSA、DES-ADH-BSA、OMT-AOAA-BSA、OMT-ADH-BSA、OMT-HBA-BSA作为免疫原免疫小鼠。经基础免疫和2～4次加强免疫后,取血清效价达1:10000以上,且每一免疫原中效价最高的小鼠作细胞融合,建立单克隆杂交瘤细胞株。结果表明免疫原DES-AOAA-BSA的效果最佳,以此免疫原建立了单克隆杂交瘤株5.2.4/3C4,该细胞株的染色体平均数为92.8。采用腹水瘤法制备了单克隆抗体,该抗体为IgG2a亚型。该抗体对DES、泰乐菌素和替米考星的交叉反应率分别为100%、53.4%、35.5%。含该单克隆抗体的腹水加入等量的甘油后,置于-20℃保存。以抗体效价和产生50%抑制的DES的浓度(IC50)作为考察指标,对其稳定性进行考察。在已保存的6个月内,抗体的效价和IC50值无明显变化,表明抗体在甘油中于-20℃保存是稳定的。应用上述抗体建立了检测泰乐菌素和替米考星间接竞争ELISA方法。采用DES为标准溶液,建立了标准曲线,y=-0.4592x+1.0671,r=0.999,检测的线性范围5～80μg/L,最低检测限1.2μg/L。组织样品用含20%～30%乙腈的0.3%偏磷酸溶液提取后,用5N NaOH调节pH至8.5～9.0,用乙酸乙酯萃取,氮气吹干,残留物用含10%甲醇的样品稀释液溶解后,用建立的ELISA方法对其检测。ELSIA方法对猪肌肉和肝脏中泰乐菌素的LOD分别为7.9μg/kg,8.4μg/kg;对替米考星的LOD分别为11.9μg/kg,12.7μg/kg。以组织添加回收率能满足ELISA分析方法要求的最低药物添加浓度作为定量限,泰乐菌素在猪肌肉中的定量限为20μg/L,在肝脏中的定量限为30μg/L;替米考星在猪肌肉中的定量限为30μg/L。定量限、0.5×MRL、MRL、2×MRL浓度的泰乐菌素和替米考星在猪肌肉和肝脏中的添加回收率均值在85%～115%之间,批内和批间变异系数均＜20%。将15kg左右的长大杂交猪8头随机分为4组,每组2头,其中一组作为空白,其余三组每头猪每天以10mg/kg剂量颈部注射酒石酸泰乐菌素,连续5d,于停药后0d、2d、5d各宰杀一组,采集颈部肌肉、背部肌肉和肝脏,空白组宰杀后,采集背部肌肉和肝脏。采集的样品经组织处理后,用建立的ELISA方法和高效液相方法（HPLC）同时测定组织中泰乐菌素的残留量。结果表明,ELISA方法和HPLC方法对肌肉和肝脏中的泰乐菌素残留量测定值的相关系数r分别为0.997,0.996,两方法具有良好的等同性。ELISA方法对背部肌肉和肝脏中泰乐菌素残留量的测定值与Prats文献报道的结果一致,但对注射部位肌肉的测定值相差较大,这可能与药物剂型不一致相关,Prats所采用的剂型为缓释制剂。本研究设计了半抗原DES和OMT,考察分析了其化学结构的差异对抗体特性的影响,这对小分子化合物抗原设计具有指导意义。本研究采用了多种化学性质不同的交联臂构建了人工免疫原,考察了交联臂对抗体特性的影响,这在大环内酯类抗生素的抗体制备研究中尚属首次。各种人工免疫中,DES-AOAA-BSA复合物的免疫效果最佳,以此免疫原制备了单克隆抗体,该抗体可同时识别泰乐菌素和替米考星,而现有的能同时识别泰乐菌素和替米考星的抗体为多克隆抗体。以此单克隆体建立了泰乐菌素和替米考星多残留ELISA检测方法并组装了试剂盒,该试剂盒能同时对组织中泰乐菌素和替米考星残留进行检测,这在国内外也属首次,该试剂盒在监测泰乐菌素和替米考星残留上将有广泛的应用前景。本论文还对小分子化合物免疫特性进行了讨论,对其他小分子化合物抗原设计有一定参考价值,在免疫学上具有一定的学术价值。

论文目录

• 摘要
• ABSTRACT
• 缩略语表
• 1 前言
• 1.1 问题的提出
• 1.2 泰乐菌素和替米考星的理化性质、代谢及残留
• 1.3 泰乐菌素和替米考星残留检测研究现状
• 1.4 研究的内容和目的意义
• 2 材料与方法
• 2.1 药品与试剂
• 2.2 仪器设备
• 2.3 试验动物及细胞
• 2.4 试液配制
• 2.5 人工抗原合成与鉴定
• 2.5.1 DES
• 2.5.2 OMT
• 2.5.3 DES（OMT）-ADH-BSA（OVA）
• 2.5.4 DES（OMT）-AOAA-BSA（OVA）
• 2.5.5 OMT-HBA-BSA（OVA）
• 2.6 小鼠免疫及血清抗体效价监测
• 2.6.1 ELISA测定程序
• 2.6.2 小鼠免疫及血清抗体水平监测
• 2.7 杂交瘤细胞株的建立
• 2.7.1 细胞复苏与冻存
• 2.7.2 传代细胞的培养
• 2.7.3 饲养细胞的制备
• 2.7.4 SP2/0骨髓瘤细胞的活化及制备
• 2.7.5 免疫鼠脾脏B淋巴细胞的制备
• 2.7.6 细胞融合
• 2.7.7 杂交瘤细胞的选择性培养
• 2.7.8 杂交瘤细胞的筛选
• 2.7.9 杂交瘤细胞的克隆化（有限稀释法）及细胞株的建立
• 2.7.10 杂交瘤细胞染色体计数
• 2.8 单克隆抗体制备及抗原抗体稳定性考察
• 2.8.1 抗体制备
• 2.8.2 抗体效价测定
• 2.8.3 抗体灵敏度测定
• 2.8.4 单克隆抗体亚型鉴定
• 2.8.5 杂交瘤细胞分泌抗体稳定性检查
• 2.9 ELISA检测方法的建立
• 2.9.1 ELISA检测条件的优化
• 2.9.2 标准曲线的建立及评价
• 2.10 ELISA方法对组织样品的检测及考核
• 2.10.1 样品的处理
• 2.10.2 Cut-off值测定
• 2.10.3 组织最低检测限和定量限
• 2.10.4 添加回收率和精密度试验
• 2.10.5 与仪器方法比对试验
• 2.10.6 动物喂养试验
• 2.11 试剂盒组装
• 2.12 试剂盒加速稳定性试验
• 2.12.1 试剂盒主要组分的加速稳定性试验
• 2.12.2 试剂盒的加速稳定性试验
• 3 结果与分析
• 3.1 人工抗原
• 3.1.1 DES结构表征
• 3.1.2 OMT结构表征
• 3.1.3 免疫原及包被原结构表征
• 3.2 免疫鼠血清抗体效价监测
• 3.3 杂交瘤细胞
• 3.3.1 杂交瘤细胞株建立
• 3.3.2 杂交瘤细胞染色体计数
• 3.4 单克隆抗体制备及考核
• 3.4.1 单克隆抗体制备
• 3.4.2 各细胞株单克隆抗体效价
• 3.4.3 各细胞株单克隆抗体灵敏度
• 3.4.4 单克隆抗体亚型
• 3.4.5 杂交瘤细胞稳定性
• 3.4.6 人工抗原稳定性
• 3.4.7 抗体稳定性
• 3.5 ELISA检测方法
• 3.5.1 ELISA检测条件的优化
• 3.5.2 标准曲线的建立及评价
• 3.6 ELISA方法对组织样品的检测及考核
• 3.6.1 Cut-off值
• 3.6.2 组织最低检测限和定量限
• 3.6.3 组织添加回收率
• 3.6.4 与仪器方法的比对
• 3.6.5 实际组织样品测定
• 3.7 试剂盒组装
• 3.7.1 试剂盒提供的材料
• 3.7.2 试剂盒中未提供但需要的材料
• 3.7.3 工作液配制
• 3.7.4 样品处理
• 3.7.5 测定程序
• 3.7.6 结果判定
• 3.8 试剂盒的加速稳定性
• 3.8.1 试剂盒主要组分的加速稳定性
• 3.8.2 试剂盒的加速稳定性
• 4 讨论
• 4.1 人工抗原的合成
• 4.1.1 半抗原设计对抗体性能的影响
• 4.1.2 交联臂及偶联比对人工抗原的影响
• 4.1.3 人工抗原设计原则
• 4.2 单克隆抗体的优缺点
• 4.3 细胞融合筛选
• 4.4 最佳ELISA反应条件的确定
• 4.5 ELISA方法检测泰乐菌素和替米考星残留的先进性和可靠性
• 4.6 试剂盒主要组成成分的稳定性
• 4.7 试剂盒需要改进的地方
• 5 结论
• 6 文献综述:ELISA在兽药残留分析中的应用
• 参考文献
• 致谢
• 附录
• 附录Ⅰ——作者简介
• 附录Ⅱ——附图
• 附录Ⅲ——原始数据
• 附录Ⅳ——细胞成活证明
• 附录Ⅴ——专利受理证明