改良的大豆子叶节转基因方法

论文摘要

随着基因工程技术的发展,采用遗传转化导入外源基因,改善大豆品质及抗病抗逆性,已成为大豆改良的重要方法之一。本文从多个层面对转基因方法的原理和进展作了详细综述,最终选取相对高效的农杆菌介导法作为大豆转基因的基础研究方法,并从种子消毒,外植体选择,农杆菌侵染和共培养,以及各培养时期植物激素种类和浓度等方面作了分析研究,以探讨大豆转基因优化研究步骤,以期在一定程度上达到提高转基因效率的目的。文章以苏云金芽孢杆菌(Bacillus thuringiensis)毒性蛋白基因Bt为目的基因,先研究未进行转染时期11种不同硼酸浓度处理对大豆子叶节丛生芽再生的影响,再从中选取代表性的硼酸浓度处理诱导期转染的大豆,观察三种硼酸浓度对大豆再生丛生芽转基因的影响,结果表明不加入硼酸时表现为严重缺硼症状,不仅生长点没有长出,而且根的生长也受到严重抑制。结果表明高浓度硼酸有较多的愈伤组织形成,外植体短期内容易死亡,不利于转基因丛生芽的再生。适宜浓度硼酸培养基诱导的大豆丛生芽长势最好,而且转基因效率也高达3.3%。对大豆抗性幼苗的根和叶片分别采用PCR、逆转录PCR和Southern blotting等方法进行筛选与鉴定,结果均获得阳性幼苗,证明外源基因已经成功转入大豆基因组中。

论文目录

• 中文摘要
• Abstract
• 引言
• 第一章 综述
• 1 大豆再生体系的建立
• 1.1 大豆器官的发生和植株再生
• 1.2 大豆体细胞胚胎发生和植株再生
• 2 大豆遗传转化的方法
• 2.1 农杆菌侵染法
• 2.1.1 农杆菌介导大豆基因转化的进展
• 2.1.2 农杆菌转化大豆的影响因素
• 2.2 基因枪转化法
• 2.3 种质转化法
• 2.3.1 花粉管通道法
• 2.3.2 子房注射法
• 2.4 其他转基因方法的应用
• 3 大豆基因转化的优选方案
• 3.1 大豆种子的消毒
• 3.2 大豆种子的萌发
• 3.3 外植体的选择
• 3.4 预培养对大豆丛生芽诱导的影响
• 3.5 大豆转化的主要影响因素
• 3.5.1 外植体的切取方式
• 3.5.2 侵染时间的选择
• 3.5.3 共培养时间
• 3.5.4 其他影响因素
• 3.6 大豆生长各时期培养基的选择
• 3.6.1 丛生芽诱导培养基的选择
• 3.6.2 丛生芽生长培养基的选择
• 3.6.3 生根培养基的选择
• 3.6.4 抗性再生幼苗的移植
• 3.7 抗性芽的筛选
• 4 植物中硼的作用
• 4.1 土壤中硼的含量及分布
• 4.2 硼胁迫对植株生长的影响
• 4.2.1 低硼胁迫下植物的影响
• 4.2.2 高硼胁迫对植物的影响
• 4.3 硼参与细胞壁的结构及功能
• 4.3.1 硼参与细胞壁的结构
• 4.3.2 硼的功能
• 4.3.2.1 硼对糖类代谢及其运输的影响
• 4.3.2.2 硼对蛋白质和核酸代谢的影响
• 5 目的基因的转化和特点
• 5.1 目的基因的直接转化法
• 5.2 目的基因—抗虫基因
• 5.2.1 抗虫基因Bt 的致病机理
• 5.2.2 抗虫基因的特点
• 5.3 抗虫基因的应用
• 6 转基因技术的应用前景
• 第二章 大豆子叶节丛生芽的诱导
• 1 材料与方法
• 1.1 材料
• 1.1.1 大豆品种
• 1.1.2 培养基
• 1.2 方法
• 1.2.1 无菌外植体的建立
• 1.2.2 外植体的萌发
• 1.2.3 大豆子叶节丛生芽的诱导
• 2 结果与分析
• 2.1 酒精消毒时间对大豆萌发的影响
• 2.2 不同萌发培养基对大豆萌发的影响
• 2.3 植物激素的不同种类和浓度对大豆子叶节诱导的影响
• 3 讨论
• 第三章 硼对大豆子叶节丛生芽的影响
• 1 材料与方法
• 1.1 材料
• 1.2 方法
• 1.2.1 无菌外植体的建立
• 1.2.2 不同硼酸浓度诱导培养基的丛生芽诱导
• 2 结果与分析
• 2.1 硼酸浓度对丛生芽数量的影响
• 2.2 硼酸浓度对丛生芽生长状况的影响
• 3 讨论
• 3.1 缺硼对植物细胞壁和生物膜的影响
• 3.2 硼对细胞成分伸展蛋白的影响
• 3.3 硼和其它元素的平衡作用
• 第四章 硼介导的外源基因（Bt）的转化
• 1 材料与方法
• 1.1 材料和试剂
• 1.1.1 植物材料
• 1.1.2 目的基因和菌种
• 1.1.3 培养基
• 1.1.3.1 LB 固体培养基
• 1.1.3.2 YEP 液体培养基
• 1.1.3.3 植物基本培养基
• 1.1.4 试剂
• 1.1.4.1 碱法提取质粒的试剂
• 1.1.4.2 50×核酸电泳缓冲液TAE
• 1.1.4.3 TE 缓冲液
• 1.1.4.4 试剂盒
• 1.2 实验方法
• 1.2.1 菌种的复苏
• 1.2.2 碱法少量快速抽提质粒DNA
• 1.2.3 质粒的酶切鉴定
• 1.2.4 大豆外植体的侵染
• 1.2.5 侵染后外植体的培养
• 1.2.6 大豆叶片总RNA 的提取
• 1.2.7 逆转录试验
• 1.2.8 Bt 基因的分子生物学检测
• 1.2.8.1 PCR 检测
• 1.2.8.2 逆转录PCR 检测
• 1.2.8.3 Southern blotting 检测
• 2 结果与分析
• 2.1 菌种的鉴定
• 2.2 PCR 和逆转录PCR 检测结果
• 2.3 Southern blotting 检测结果
• 3 讨论
• 第五章 结论与展望
• 5.1 大豆子叶节诱导体系
• 5.2 硼的选择对大豆基因转化的影响
• 5.3 外源基因Bt 的转化方法与表达检测
• 5.4 问题与展望
• 参考文献
• 攻读硕士学位期间发表的学术论文
• 常用词缩写表
• 致谢