NS1蛋白42位氨基酸的改变对H5N1亚型禽流感病毒致病性影响的研究

论文摘要

本研究选择1株分离于中国大陆的H5N1亚型高致病性禽流感毒株A/Duck/Guangxi/27/2003(H5N1)(简称DK27),对其NS基因进行定点突变使NS1蛋白42位丝基酸改变为甘氨酸,利用反向遗传技术拯救重组突变病毒(RDK27NS1S42G),并用该病毒进行小鼠的感染性试验,判定禽流感病毒NS1蛋白42位氨基酸改变是否影响DK27对小鼠的致病性。我们首先对DK27的病毒基因组进行克隆测序,将所得8条RNA片段分别克隆PBD载体构建成转染质粒并共转染293T细胞,利用反向遗传技术成功拯救出重组亲本病毒RDK27。通过比较DK27和RDK27对小鼠的致病性试验结果发现:小鼠经106EID50病毒鼻腔接种感染后体重下降明显,且在感染后7天100%致死,两株病毒均表现为明显的高致病性,拯救的重组亲本病毒毒力没有发生变化。为了验证H5N1亚型禽流感病毒NS1蛋白42位氨基酸改变对病毒致病性的影响,我们对NS基因进行定点突变使NS1蛋白42位丝基酸改变为甘氨酸,NS1突变基因经序列判定无误克隆PBD载体构建转染质粒,和其它7个RNA基因的转染质粒共转染293T细胞,利用反向遗传技术拯救出重组突变病毒RDK27NS1S42G。通过RDK27NS1S42G对小鼠的致病性试验结果发现:106EID50病毒经鼻腔接种感染小鼠后4、6天在肺脏中一直保持较高的含量,达107.03 EID50以上;脑中含量次之,但随时间的增加逐渐升高;肾脏﹑脾脏虽可分离到病毒,但含量均不高,小鼠经106EID5病毒鼻腔接种感染后体重下降明显,且在感染后7天100%致死。由此判定重组突变病毒均可通过呼吸系统侵入其他组织器官,并突破血脑屏障侵入大脑组织,最终引起小鼠死亡,对小鼠仍然表现为高致病力。与RDK27对小鼠的致病性比较发现,拯救的重组突变病毒对小鼠的致病性没有发生明显变化。由此判定:NS1蛋白42位氨基酸由丝氨酸(Ser)改变为甘氨酸(Gly)没有使DK27对小鼠的高致病性发生改变。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 第一部分 文献综述
• 1 禽流感的概述
• 2 禽流感病毒的概述
• 3 流感病毒与宿主的免疫反应
• 4 A 型流感病毒反向遗传操作技术
• 5.本论文拟解决的问题
• 6.本文研究的意义
• 第二部分 研究报告
• 试验一 A/Duck/Guangxi/27/2003（H5N1）禽流感病毒全基因的克隆及测序
• 1 材料
• 1.1 毒株及实验动物
• 1.2 主要试剂
• 1.3 溶液配制
• 1.4 主要仪器
• 1.5 引物设计
• 2 方法
• 2.1 病毒的增殖
• 2.2 病毒RNA 的提取
• 2.3 病毒基因组的反转录
• 2.4 反转录产物的PCR 反应
• 2.5 PCR 产物的回收与处理
• 2.6 PCR 产物的克隆
• 2.7 质粒 DNA 鉴定
• 3 结果与分析
• 3.1 全基因 RT-PCR 扩增结果
• 3.2 全基因的克隆与鉴定
• 3.3 质粒 DNA 的 PCR 鉴定结果
• 3.4 cDNA 的序列测定
• 4 讨论
• 试验二 A/Duck/Guangxi/27/2003（H5N1）禽流感病毒的感染性克隆建立及重组亲本病毒的救获
• 1 材料
• 1.1 病毒分离株及实验动物
• 1.2 主要试剂
• 1.3 引物
• 1.4 PBD 载体
• 2 方法
• 2.1 病毒 RNA 提取、反转录与 PCR
• 2.2 感染性克隆的建立
• 2.3 病毒救获
• 3 结果
• 3.1 阳性PBD 克隆质粒电泳鉴定结果
• 3.2 阳性 pBD 克隆质粒酶切产物电泳鉴定结果
• 3.3 救获重组病毒（RDK27）的检测与鉴定结果
• 4 讨论
• 试验三 A/Duck/Guangxi/27/2003（H5N1）禽流感病毒和重组亲本病毒对小鼠的致病性试验
• 1 材料
• 1.1 病毒
• 1.2 实验动物
• 2 方法
• 50的测定'>2.1 两株病毒EID₅₀的测定
• 2.2 病毒对鸡的毒力测定（IVPI）
• 2.3 病毒对小鼠的致病性试验
• 3 结果
• 50 的测定结果'>3.1 病毒EID₅₀的测定结果
• 3.2 病毒对鸡的毒力测定结果
• 3.3 病毒对小鼠的致病性试验结果
• 3.3.1 感染病毒后小鼠死亡情况
• 6EID₅₀ 病毒感染后小鼠的体重变化情况'>3.3.2 10⁶EID₅₀病毒感染后小鼠的体重变化情况
• 3.3.3 病毒感染小鼠的组织嗜性结果
• 4 讨论
• 试验四 A/Duck/Guangxi/27/2003（H5N1）禽流感病毒 NS1 蛋白 42 位氨基酸改变后对小鼠致病性影响的试验
• 1 材料
• 1.1 病毒株及实验动物
• 1.2 pBD 载体
• 1.3 引物
• 2 方法
• 2.1 NS 基因的定点突变
• 2.2 重组突变质粒的构建
• 2.3 阳性重组突变质粒的鉴定
• 2.4 NS 基因突变病毒的救获
• 2.5 救获的重组突变病毒（简称为 RDK27NS1S42G）的鉴定
• 2.6 重组突变病毒对小鼠的致病性试验
• 3 结果
• 3.1 NS 突变基因后 RT-PCR 结果
• 3.2 NS 重组突变质粒电泳鉴定结果
• 3.3 NS 重组突变质粒的序列测定结果
• 3.4 救获的重组突变病毒（简称为 RDK27NS1S42G）的鉴定结果
• 3.5 重组突变病毒对小鼠的致病性试验结果
• 4 讨论
• 参考文献
• 结论
• 致谢
• 作者简介
• 附录