萝卜芥蓝远缘杂交诱发的rRNA基因沉默现象

论文摘要

远缘杂交育种技术将异种属物种的有利性状相互融合,可以创造新的物种,突破常规育种的限制,是今后育种的重要方向。植物远缘杂交可能会造成核仁显性现象,即源于一个亲本的rRNA基因沉默,而源于另一个亲本的rRNA基因表达。本研究采用人工去雄授粉的方法,以萝卜（Raphanus sativus L. RR,2n=18）为母本、芥蓝（Brassica alboglabra Bailey, CC,2n=18）为父本进行杂交,并通过胚抢救（Embryo Rescuing）得到了6棵F1代植株,经形态学观察,初步确定均为杂交所得。本研究通过去壁低渗火焰干燥法获得萝卜、芥蓝、F1代和F10代以上植株的子房染色体涂片,亲本基因组DNA采用CTAB法提取。用Bio-11-dUTP标记的萝卜基因组做探针,通过原位杂交发现F1代每个分裂相中的18条染色体中并不全是一半来自父本,一半来自母本,这可能与杂种细胞中发生染色体重组有关,但可以表明其均为萝卜和芥蓝杂交所得；用Dig-11-dUTP标记的45S rDNA质粒做探针,通过原位杂交发现萝卜和芥蓝子房染色体涂片中每个分裂相都含有4个45 S rDNA位点；以Bio-11-dUTP标记的萝卜基因组和Dig-11-dUTP标记的45S rDNA质粒做双探针,原位双杂交结果发现,F1代和F1o代以上的子房染色体分裂相中分别含有4个和8个45S rDNA位点,F1代中两亲本的各占一半,而F1o代以上却发现5个45SrDNA位点来自母本,3个来自父本,这可能也与染色体重组有关。但是在杂种细胞中,都含有来自两亲本的45S rDNA位点。本研究采用同源序列法克隆出芥蓝rRNA基因间隔区序列,并与萝卜rRNA基因转录起始位点（+1）之后的序列比对,设计通用引物,进行RT-PCR,凝胶回收RT-PCR产物并测序,序列比对结果表明,F1代和F10代以上RT-PCR产物序列与芥蓝的一致。因此,可以看出萝卜芥蓝远缘杂交中同样诱发了核仁显性现象：来自芥蓝的rRNA基因表达,而来自萝卜的rRNA基因沉默。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 缩略语
• 1 前言
• 1.1 植物远缘杂交
• 1.2 胚抢救在远缘杂交中的应用
• 1.3 杂种鉴定
• 1.3.1 形态学鉴定
• 1.3.2 细胞学鉴定
• 1.3.3 同工酶分析
• 1.3.4 分子标记技术
• 1.4 远缘杂交与核仁显性现象
• 1.4.1 表观遗传变化
• 1.4.2 核仁显性现象的发现
• 1.4.3 真核生物rRNA基因与核糖体的结构与功能
• 1.4.4 核仁显性的机制
• 1.4.4.1 增强子不平衡模型（The enhancer imbalance model）
• 1.4.4.2 物种特异转录因子模型（The Species-specific transcription factor model）
• 1.4.4.3 染色质修饰模型（The chromatin modification model）
• 1.4.4.4 染色质印记模型（The chromatin imprinting model）
• 1.4.5 染色体银染技术在核仁显性现象中的应用
• 1.4.5.1 染色体银染技术的发展历史
• 1.4.5.2 银染的特异性和化学基础
• 1.4.5.3 银染与rRNA基因的活动
• 1.5 本课题的目的和意义
• 2 材料和方法
• 2.1 实验材料和试剂
• 2.1.1 实验材料
• 2.1.2 实验试剂
• 2.2 实验方法
• 10代以上植株的培养'>2.2.1 亲本及F₁₀代以上植株的培养
• 2.2.2 胚抢救
• 2.2.3 形态学初步鉴定
• 2.2.4 CTAB法提取基因组DNA
• 2.2.5 细胞学观察和原位杂交分析
• 2.2.5.1 探针标记
• 2.2.5.2 原位杂交制片
• 2.2.5.3 原位杂交
• 2.2.6 芥蓝rDNA间隔区的克隆
• 2.2.7 萝卜芥蓝rDNA序列比对（+1之后）及通用引物设计
• 2.2.8 RNA的提取及表达分析
• 2.2.8.1 Trizol法提取植物总RNA
• 2.2.8.2 RNA质量检测
• 2.2.8.3 RNA中基因组DNA的消除
• 2.2.8.4 总RNA的反转录
• 2.2.8.5 RT-PCR及产物序列比对分析
• 3 实验结果与分析
• 1代的获得'>3.1 杂交植株F₁代的获得
• 3.2 形态学初步鉴定
• 3.3 高质量DNA的提取
• 3.4 细胞学观察和原位杂交分析
• 3.4.1 原位杂交子房染色体涂片的获得
• 1代细胞学鉴定'>3.4.2 F₁代细胞学鉴定
• 3.4.3 亲本45S rDNA探针原位杂交结果
• 3.4.4 原位双杂交结果
• 3.5 芥蓝RDNA间隔区的克隆
• 3.5.1 PCR扩增结果
• 3.5.2 芥蓝间隔区测序结果
• 3.6 萝卜芥蓝RDNA序列比对（+1之后）及通用引物设计
• 3.7 RNA的提取及表达分析
• 3.7.1 植物总RNA的提取
• 3.7.2 RT-PCR及产物序列比对分析
• 4 讨论
• 1代的鉴定'>4.1 远缘杂交中杂种F₁代的鉴定
• 4.2 良好的染色体制片的获得
• 4.3 萝卜芥蓝RDNA间隔区重复序列的分析
• 4.4 影响萝卜芥蓝远缘杂交中核仁显性现象的其它可能原因
• 4.4.1 基因组遗传效力与核仁显性的关系
• 4.4.2 rRNA基因间隔区序列甲基化与核仁显性的关系
• 参考文献
• 致谢