论文摘要
肺气肿是一种慢性阻塞性肺疾病,其主要特点是肺泡结构的破坏、肺组织弹性的消失、肺泡腔的扩张。在世界范围内肺气肿是主要的慢性病之一,也是死亡的主要原因之一。肺气肿的很多分子生物学发病机制来自于研究啮齿类动物模型,包括基因操控技术构建的小鼠模型。关于肺气肿相关的研究概括如下。首先,肺组织发育缺陷导致肺气肿。例如,在血小板衍生生长因子A缺失小鼠模型中肺泡间隔肌纤维母细胞发育缺陷,从而导致肺组织发育异常。这些小鼠肺气肿的发病及进展继发于肺泡间隔发育不良,从而弹性纤维蛋白及肺泡间隔的缺陷。然而这种由发育异常导致的肺气肿与发育正常的肺组织被破坏所致的肺气肿截然不同。第二,损伤因素内源性破坏蛋白酶与抗蛋白酶平衡。这种失衡促使组织水解,导致肺泡间隔基质蛋白的水解,从而导致肺泡间隔破坏。最初人们发现吸入木瓜蛋白酶气溶胶可引起肺气肿,目前通过对更多基因操控技术构建的动物模型的研究,发现蛋白酶活性的过强或抗蛋白酶活性的缺乏可导致肺气肿。第三,氧化剂/抗氧化剂失衡,肺组织中氧化剂和自由基的过剩促使细胞和组织损伤,这也是该病发病的主要起因之一。当氧化剂和抗氧化剂失衡并倾向于氧化剂过度产生或/和抗氧化剂缺乏,氧化应激便会产生。氧化应激不仅导致直接肺损伤,而且激活分子机制,从而开启了肺部炎症程序。第四,最近研究认为肺实质细胞凋亡是肺气肿产生的一个关键步骤。动物肺气肿模型中已经显示出肺实质细胞凋亡异常升高现象。例如,Kasahara等证实了血管内皮生长因子受体（VEGF受体）信号传导途径是维持肺泡结构所必要的,VEGF受体的慢性阻滞可能会诱导细胞凋亡而引起肺气肿。此外,关于衰老、自身免疫的全新概念目前引起广泛关注,例如,衰老标志蛋白（SMP-30）缺乏可导致肺气肿。动物模型中T淋巴细胞介导的炎症反应在吸烟诱导的肺气肿发病机制中起重要作用,这种获得性免疫的证据已经得到了阐明,尽管和一些文献报道存在一定的分歧。最后,炎症应答使蛋白酶/抗蛋白酶失衡、氧化剂/抗氧化剂失衡、细胞凋亡异常,从而成功构建肺气肿小鼠模型。这些不同的发病机制可以独立地或协同地直接或间接的损害肺泡结构,最终导致肺气肿。α/β水解酶家族编码蛋白质的3个cDNAs从小鼠肺气肿模型肺组织cDNA文库中被克隆;这3个cDNAs被命名为α/β水解酶基因1、2、3。这三个α/β水解酶家族编码蛋白质均有一个单独的氨基端跨膜区。虽然这个基因家族编码的蛋白质通常表现出酶的生物学特性,例如脂肪酶,但这三个基因编码的蛋白所具有的功能尚不清楚。我们运用基因捕获、插入、诱变技术构建了一种Abhd2基因敲除小鼠。虽然宫田等研究发现Abhd2蛋白（Abhd2基因编码）在肺泡Ⅱ型细胞表达,但仍需要阐明它在肺脏中的功能。在这个研究中,我们证实了Abhd2敲除小鼠自发地、渐进性地形成肺气肿,且呈持续、进展状态。材料和方法1、基因敲除小鼠及鉴定基因型基因敲除鼠模型(Abhd2-（Gt/Gt）:利用基因捕获、插入、诱变技术构建了一种Abhd2基因敲除小鼠。在这项研究中,我们使用的实验鼠属于该鼠系的第十代（F10）。运用PCR技术,以基因组DNA做模板,鉴定实验鼠基因型。2、RNA分析用Northern印记和逆转录PCR进行mRNA表达评估。Northem biot分析按试剂合说明书完成。RT-PCR技术分析中,RNA样本反转录是按照制造商的指示说明进行ThermoScriptTMRT-PCR系统(InvitrogenTM)。基因特异性引物用来扩增每个目的基因片段。每一基因mRNA模板的数量与产量成正比例,PCR的产量由最优的实验循环次数完成的,而最优的循环次数是由实验决定的。Hprt被用来做内部标准。扩增的PCR产物通过溴化乙锭凝胶电泳,电泳带的密度运用ImageJ软件(1.38版,（http:∥rsb.info.nih.gov/ij/docs/index.html）进行辉度分析,统计学处理。3、Western印迹分析将肺组织匀浆在裂解物缓冲液中同质化加工处理提取蛋白质。此裂解物缓冲液是由美国西格玛-奥尔德里奇,圣路易斯公司生产,成份为HEPES 50 mmol/l,pH7.4,氯化钠150 mmol/l,聚乙二醇辛基苯基醚0.1%,甘油10%,氟化钠1 mmol/l,原钒酸钠2 mmol/l,乙二胺四乙酸1 mmol/l,和一种蛋白酶抑制剂混合物（1:100稀释度）。将蛋白提取物（每泳道60μg蛋白质）在12%SDS-PAGE凝胶电泳,电泳后用聚偏氟乙烯膜（PVDF）（美国Millipore,Billerica公司）转膜。初级抗体及使用浓度分别为:山羊抗小鼠Sftpal抗体（稀释度1:500;美国,圣克鲁斯,圣克鲁斯生物技术公司）,山羊抗小鼠Sftpb抗体（稀释度1:500;美国,圣克鲁斯,圣克鲁斯生物技术公司）,兔抗鼠Sftpb抗体（稀释度1:200;美国,圣克鲁斯,圣克鲁斯生物技术公司）,和鼠抗鼠Sftpd抗体（稀释度1:500;美国,圣克鲁斯,圣克鲁斯生物技术公司）。然后用标记HRP的二级抗体来检测。（该抗体稀释度1:200;美国Burlingame矢量实验室）。使用Image J软件进行辉度分析,统计学处理等。4、组织学和形态计测学分析选不同年龄组（2月龄,4月龄,6月龄,12月龄）的Abhd2基因敲除纯合子和野生对照小鼠各2匹,小鼠腹腔内注射（0.01ml/10g体重）戊巴比妥钠（Nembutal sodium solution,50mg/ml）麻醉,暴露气管及胸腔,从气管向肺内以25厘米高水柱的压力滴注10%中性甲醛1分钟,使其膨胀固定。取全肺,10%中性甲醛固定24小时,用石蜡包埋,并切成2um薄的切片,将切片用苏木精和伊红染色。随机选择20份组织切片,每份切片随机选定某区域,通过平均线性截距量化气腔扩大情况。5、免疫组织化学和免疫荧光分析将实验鼠经乙醚麻醉后处死。取出肺脏,用4%低聚甲醛的磷酸盐缓冲液固定,石蜡包埋,制作4微米厚切片后,免疫组织化学和免疫荧光分析:使用鼠抗Ⅱ型肺泡细胞板层小体蛋白的单克隆抗体（p180）（稀释度1:250;美国德州圣安东尼奥GeneTex股份有限公司）进行肺Ⅱ型细胞的特异性免疫组化染色,用大鼠抗小鼠F4/80抗体（美国圣地亚哥生物科技网络公司）进行巨噬细胞免疫组织化学染色。然后分别使用辣根过氧化物酶标记的抗鼠二级抗体（稀释度1:200;美国Burlingame矢量实验室）及过氧化物酶标记的抗大鼠二级抗体（日本东京NichireiMAX-PO（Rat）Histofine单染色法）、以及生物素标记的抗兔二级抗体（稀释度1:200,VectastainABC Kit;美国Burlingame矢量实验室）按照制造商说明再染色后检测肺Ⅱ型细胞及巨噬细胞的数量。弹性蛋白用弹性组织万吉森染色试剂盒检测。（德国64271 Darmstadt,默克KGaA）。为了明确Abhd2蛋白是否在Ⅱ型肺泡上皮细胞表达我们通过免疫荧光方法来验证。使用鼠抗肺泡Ⅱ型细胞板层小体蛋白的特异性单克隆抗体（p180）和兔抗β-半乳糖苷酶抗体染色后,再使用免疫荧光二级抗体即爱力生荧光素594标记的抗小鼠二级抗体和爱力生荧光素488标记的抗兔二级抗体（Eugene,OR,分子探针）免疫荧光染色。细胞核由DAPI（0.1μg/mL;日本东京西格玛-奥尔德里奇公司）染色并用BZ-9000荧光显微镜（日本大阪KEYENCE）观察染色后的细胞。我们在每匹小鼠切片中随机选10个放大400倍视野检测巨噬细胞和Ⅱ型肺泡上皮细胞（它们分别被抗小鼠F4/80抗体和抗P180抗体免疫染色鉴定）并进行细胞计数及统计学分析。6、肺泡灌洗液和肺匀浆小鼠腹腔内注射戊巴比妥钠（100 mg/kg）麻醉。暴露气管及胸腔,取灭菌生理盐水1ml,从气管向肺内缓慢注入,然后缓慢吸出,共抽吸3次,作为支气管肺泡灌洗液。灌洗液立即离心（450xg,10分钟,4℃）以去除细胞。离心后的上清液用来测量磷脂酰胆碱、饱和磷脂酰胆碱（DSPC）和蛋白。然后切断小鼠远端动脉,放血处死小鼠,取全肺在无菌盐水中经过同质加工处理,再经上述方法测定。7、生物化学测定灌洗液和肺组织匀浆液中磷脂酰胆碱（PC）含量,直接采用磷脂-C分析试剂盒测定（Wako Pure化学工业株式会社,日本大阪）。饱和磷脂酰胆碱（DSPC）从灌洗液和肺组织匀浆液脂类提取物中分离获得。四氧化锇先与脂类反应,随后磷脂酰胆碱被测定。灌洗液和肺组织匀浆液中总蛋白测定是采用史密斯等人测定方法进行的。8、TUNEL检测采用ApopTag过氧化物酶原位细胞凋亡检测试剂盒（S7100;美国加利福尼亚Temecula,国际Chemicon公司）。末端缺口标记细胞凋亡检测法（TUNEL法）检测凋亡细胞。9、统计分析所有数值均以均数±标准差表示。两组间比较使用t检验,以P<0.05。作为有显著性意义的标准。结果1、β-半乳糖苷酶在Ⅱ型肺泡上皮细胞的表达在Abhd2Gt/Gt鼠中,β-半乳糖苷酶基因通过捕获载体插入到小鼠Abhd2基因位点。应用兔抗β-半乳糖苷酶抗体和鼠抗P180抗体进行免疫荧光分析,我们可以判断Abhd2基因实际上是否在肺泡Ⅱ型细胞中表达。毗哺半乳糖苷衍生物阳性细胞亦被兔抗P180抗体着色,这表明肺泡Ⅱ型细胞Abhd2基因位点存在表达。2、形态学和组织化学分析结果光学显微镜下对肺脏组织形态学评估结果显示,小于6个月龄的Abhd2Gt/Gt小鼠肺组织形态未见异常变化,而6个月龄及12个月龄的Abhd2Gt/Gt小鼠的肺脏表现出肺气肿改变。通过对2、4、6和12个月龄的小鼠肺组织切片进行形态计测学定量测定结果分析,6个月龄及12个月龄的Abhd2Gt/Gt鼠肺泡平均线形截距的均值比同龄野生型小鼠大,且随着年龄的增加而更加明显,并具有显著性差异。12个月龄的Abhd2Gt/Gt小鼠的肺脏中Ⅱ型肺泡上皮细胞的数量较野生型对照组小鼠减少,具有显著性差异;但6个月的Abhd2Gt/Gt小鼠肺脏中Ⅱ型肺泡上皮细胞的数量与野生型对照小鼠比无差异。我们将切片用EVG染色,目的是观察弹性纤维蛋白,结果显示6个月龄及12个月龄的Abhd2Gt/Gt鼠与野生型对照小鼠比弹性纤维蛋白含量减少,且具有显著性差异。虽然肺表面活性物质对于肺表面张力和气体交换是必要的,但表面活性物质中磷脂类作用还包括抗炎作用。因此我们分析了Abhd2Gt/Gt小鼠肺脏中巨噬细胞的数量。结果发现巨噬细胞的数量在小鼠4个月龄前未见改变,但6个月龄和12个月龄Abhd2Gt/Gt鼠与野牛型对照比巨噬细胞数量明显增多,随着年龄的增加更加明显,且具有显著性差异。3、肺组织和肺泡灌洗液中脂类和蛋白质类含量测定结果为了判定Abhd2基因敲除是否干扰表面活性物质磷脂和蛋白质的合成和分泌,我们对支气管肺泡灌洗液和肺组织匀浆液中的磷脂酰胆碱（PC）、饱和磷脂酰胆碱（DSPC）、蛋白质含量进行检测。在支气管肺泡灌洗液中,Abhd2Gt/Gt小鼠的磷脂酰胆碱（PC）含量在2月龄、6月龄和12个月龄均低于野生型小鼠,具有显著性差异。而Abhd2Gt/Gt小鼠饱和磷脂酰胆碱（DSPC）、蛋白质的量基本没有改变。在Abhd2Gt/Gt和野生型对照小鼠肺组织中磷脂酰胆碱（PC）、饱和磷脂酰胆碱（DSPC）、蛋白质含量无明显差别,但是6个月龄Abhd2Gt/Gt鼠磷脂酰胆碱（PC）较低。这些结果表明,Abhd2Gt/Gt鼠肺泡灌洗液中磷脂酰胆碱（PC）的含量减少是由于磷脂含量减少而不是因为DSPC减少。我们还分析了肺泡表面活性相关蛋白质（SPs）的表达水平。结果显示Abhd2Gt/Gt小鼠与野生型小鼠比较SP-A,SP-B,SP-C,SP-D在mRNA和蛋白表达水平无显著差异。4、蛋白酶和抗蛋白酶的改变为了明确Abhd2Gt/Gt小鼠肺气肿发病机制,我们使用RT-PCR方法比较Abhd2Gt/Gt小鼠与野生型B6小鼠的肺组织中基质金属蛋白酶、组织蛋白酶、金属蛋白酶组织抑制剂的mRNA表达水平。结果表明,12个月龄Abhd2Gt/Gt小鼠与野生型对照比肺组织中基质金属蛋白酶9、基质金属蛋白酶12、基质金属蛋白酶13、基质金属蛋白酶14、组织蛋白酶B、组织蛋白酶K、组织蛋白酶S的mRNA表达水平明显增高,而金属蛋白酶组织抑制剂3mRNA表达水平明显下降,两组间具有显著性差异。但是基质金属蛋白酶2、组织蛋白酶H、组织蛋白酶L、金属蛋白酶组织抑制剂-1、金属蛋白酶组织抑制剂-2、金属蛋白酶组织抑制剂-4的表达水平未见差异。这些数据表明蛋白酶/抗蛋白酶失衡与Abhd2Gt/Gt小鼠肺气肿形成有重要的关系。5、氧化和抗氧化因子的改变我们用RT-PCR方法比较Abhd2Gt/Gt小鼠与野生型B6小鼠的肺组织中α1-抗胰蛋白酶、氧化氮、超氧化物歧化酶、TLR4.、Nrf2的mRNA表达水平。然而,在Abhd2Gt/Gt小鼠与野生型B6小鼠的肺组织中,这些氧化剂与抗氧化剂的mRNA表达水平未见异常,这提示氧化剂/抗氧化剂不是Abhd2Gt/Gt小鼠致肺气肿形成的因素。6、致炎细胞因子的改变肺部炎症的加剧和可溶性的介质的过度表达在人类以及实验动物模型的肺气肿发病机制中起重要作用。因此,我们探讨了Abhd2基因敲除小鼠肺脏的炎症细胞因子表达水平是否升高。如我们所推测结果显示,Abhd2基因敲除纯合子小鼠与野生型对照小鼠比肺组织中白细胞介素-1β、白细胞介素-6、白细胞介素-13和肿瘤坏死因子-a的mRNA表达明显增高,两组间具有显著的差异。7、肺脏的细胞凋亡情况动物的肺气肿模型中已经发现肺实质细胞凋亡异常增多的现象。因此我们检测了干扰素-γ、肿瘤生长因子-β、整联蛋白-β6、天冬氨酸特异性半胱氨酸蛋白酶半胱天冬酶-3、肿瘤坏死因子α的mRNA表达水平。结果显示Abhd2Gt/Gt小鼠与野生型对照比肺组织中,干扰素-γ、肿瘤牛长因子-α的mRNA表达水平明显增高,而血管内皮生长因子的mRNA表达水平降低,且两组间具有显著性差异。同时我们检测了凋亡细胞的数量。结果显示6个月龄和12个月龄Abhd2Gt/Gt小鼠与同龄野生型对照小鼠比TUNEL染色阳性细胞数量明显增多,具有显著性差异。这些结果显示细胞凋亡在Abhd2Gt/Gt小鼠肺肺气肿的发病过程中发挥火键的作用。结论1、Abhd2蛋白在肺Ⅱ型细胞表达,Abhd2基因的缺失导致肺泡灌洗液中磷脂酰胆碱水平的下降。2、Abhd2基因敲除小鼠肺组织中巨噬细胞浸润增加、致炎细胞因子释放增多、蛋白酶与抗蛋白酶失衡和细胞凋亡异常增加,从而自发形成肺气肿。而且肺气肿的发生、发展过程与人类相似。3、肺泡表面磷脂代谢的紊乱可以导致肺气肿的发生,Abhd2基因在维持肺结构完整性上发挥着关键的作用。
论文目录
相关论文文献
- [1].ABHD2基因与慢性阻塞性肺疾病关系的研究进展[J]. 现代生物医学进展 2016(11)
- [2].Abhd2基因与肺气肿发病机制研究[J]. 现代生物医学进展 2011(23)
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