产甘油假丝酵母GPD和GPP基因的克隆及其在酿酒酵母和烟草中表达

论文摘要

干旱、盐碱、低温等逆境条件是严重影响栽培植物生长发育的非生物胁迫因素。它们不仅导致粮食产量的大幅度减产,而且使农作物的种植面积大大减少,从而进一步加剧了粮食短缺的矛盾。因此,如何改良植物对逆境胁迫的抗性一直是当前世界上研究的热点之一。分子生物学与生物技术的发展,为人们改良作物的抗非生物逆境性能开拓了新的途径。甘油是一种极其理想的耐高渗透压介质。一般的植物细胞中也能合成甘油,但生成量极少,难以达到维持细胞耐高渗的功能。本实验室在前期的研究中,筛选到了一株耐高渗过量合成甘油的假丝酵母WL2002-5。运用PCR的方法,从产甘油假丝酵母WL2002-5中扩增出了产甘油关键酶3-磷酸甘油脱氢酶（glycerol 3-phosphate dehydrogenase, GPD）和3-磷酸甘油磷酸酶（glycerol3-phosphate phosphatase, GPP）的基因GPD和GPP。对这两个基因测序,发现其与酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）的GPD、GPP基因的相似性达99%。本论文将假丝酵母WL2002-5的甘油合成基因在S. cerevisiae W303-1A中进行了异源表达,并进一步成功地构建了重组烟草。此研究为获得具有优良抗逆性植物走出了重要的一步。首先构建了可以在酿酒酵母Saccharomyces cerevisiae W303-1A中表达的重组质粒pYX212-GPD、pYX212-GPP。实验结果发现,S. cerevisiae W303-1A （pYX212-GPD）发酵72小时后,发酵液中甘油含量为18 gL-1;而S. cerevisiae W303-1A（pYX212-GPP）和S. cerevisiae W303-1A相差不大,只有6 gL-1。这说明GPD基因的导入有利于S.cerevisiae W303-1A对甘油的积累。而后构建了它们在烟草中的表达载体pBI121-GPD、pBI121-GPP、pCAMBIA 3300-GPD、pCAMBIA3300-GPP,以及它们的串联表达载体pCAMBIA3300 -GPD-GPP。通过根癌农杆菌（Agrobacterium tumefaciens）LBA4404介导转入烟草。建立了一种快速鉴定转基因植物的方法。用此法对T0代转基因烟草进行PCR验证,证明基因GPD、GPP、GPD和GPP串联基因成功的整合到转基因烟草的基因组。

论文目录

• 摘要
• ABSTRACT
• 第一章 绪论
• 1.1 植物抗逆基因工程研究
• 1.1.1 耐盐机制及相关基因工程进展
• 1.1.2 抗冻机制及相关基因工程进展
• 1.1.3 抗氧化及相关基因工程进展
• 1.1.4 用于提高植抗非生物逆境胁迫能力的基因
• 1.1.5 甘油与植物抗逆的研究进展
• 1.2 植物基因工程育种
• 1.2.1 植物基因转化技术
• 1.2.2 植物基因转化的受体系统
• 1.3 甘油的特点及甘油代谢
• 1.3.1 甘油与甘油的特点
• 1.3.2 甘油的合成
• 1.4 立题背景及本文的研究任务
• 第二章 产甘油假丝酵母产甘油关键基因GPD、GPP 的克隆及序列分析
• 2.1 材料和方法
• 2.1.1 菌株
• 2.1.2 酶和试剂
• 2.1.3 产甘油假丝酵母染色体DNA 的制备
• 2.1.4 PCR 引物
• 2.1.5 PCR 扩增反应体系及反应条件
• 2.1.6 PCR 产物胶回收
• 2.1.7 大肠杆菌感受态细胞的制备
• 2.1.8 GPD、GPP 与pEGM-T-Easy vector 连接
• 2.1.9 转化
• 2.1.10 质粒DNA 的提取
• 2.1.11 转化子的筛选鉴定
• 2.1.12 GPD、GPP 的测序
• 2.2 结果
• 2.2.1 GPD、GPP 基因的扩增与重组质粒的鉴定
• 2.2.2 GPD、GPP 基因的测序结果
• 2.3 小结
• 第三章 产甘油假丝酵母产甘油关键基因GPD、GPP 在酿酒酵母中的表达
• 3.1 材料与方法
• 3.1.1 菌种和质粒
• 3.1.2 培养基
• 3.1.3 工具酶
• 3.1.4 主要试剂
• 3.1.5 质粒DNA 的提取
• 3.1.6 大肠杆菌感受态细胞的制备
• 3.1.7 转化大肠杆菌
• 3.1.8 转化子的筛选鉴定
• 3.1.9 酿酒酵母的高效转化
• 3.1.10 酵母质粒的提取方法
• 3.1.11 甘油测定方法
• 3.1.12 菌体干重测定
• 3.2 结果
• 3.2.1 pYX212-GPD 和pYX212-GPP 的构建
• 3.2.2 表达载体pYX212-GPD 和pYX212-GPP 的酶切验证
• 3.2.3 对发酵液中甘油累积及生物量的影响
• 第四章 产甘油假丝酵母产甘油关键酶基因GPD、GPP 的植物表达载体的构建
• 4.1 材料与方法
• 4.1.1 菌种和质粒
• 4.1.2 培养基
• 4.1.3 主要试剂
• 4.1.4 工具酶
• 4.1.5 PCR 引物
• 4.1.6 PCR 扩增反应体系及反应条件
• 4.1.7 PCR 产物胶回收
• 4.1.8 质粒DNA 的提取
• 4.1.9 大肠杆菌感受态细胞的制备
• 4.1.10 转化大肠杆菌
• 4.1.11 A.tumefaciens LBA4404 感受态的制备
• 4.1.12 电击转化A. tumefaciens LBA4404
• 4.1.13 A. tumefaciens LBA4404 的质粒提取
• 4.2 结果
• 4.2.1 p81121-GPD 和p81121-GPP 的构建
• 4.2.2 pCAMBIA3300-GPD 和pCAMBIA3300-GPP 的构建
• 4.2.3 pEGM-T-Easy-CaMV 355-GPP-Tnos 和pCAMBIA3300-GPD-GPP 的构建
• 4.2.4 电击转化A. tumefaciens LBA4404
• 4.3 本章小结
• 第五章 利用根癌农杆菌L84404 将GPD、GPP 转化烟草NC89 及转基因植物鉴定方法的建立
• 5.1 材料
• 5.1.1 烟草
• 5.1.2 转基因植物样品
• 5.1.3 菌种
• 5.1.4 培养基
• 5.1.5 主要生化试剂
• 5.1.6 PCR 引物
• 5.2 方法
• 5.2.1 外植体的获取
• 5.2.2 重组A.tumefaciens L84404 的活化
• 5.2.3 共培养
• 5.2.4 再生筛选培养
• 5.2.5 生根培养
• 5.2.6 转基因植物的快速PCR 鉴定
• 5.3 结果
• 5.3.1 抗性烟草的筛选
• 5.3.2 染色体DNA 的提取
• 5.3.3 转基因烟草PCR 鉴定结果
• 5.3.4 转基因植物的快速PCR 鉴定方法的准确性检验结果
• 5.4 小结
• 主要结论
• 参考文献
• 硕士研究生期间发表的论文
• 致谢