PPV SC-1株VP2基因的不同位点插入PCV2 ORF2基因对PPV VPLs形成的影响

论文摘要

本研究将扩增得到的PPV SC-1株VP2基因产物克隆到pMD18-T Simple载体上，得到了重组质粒pMD-VP2。再将扩增得到的PCV2 SC株ORF2基因插入PPV SC-1株VP2基因的HindⅢ和SacⅠ两个特异限制酶切位点处（分别位于PPV VPLs的N端1／3和C端1／3处），得到重组质粒pPVP2-ORF2．H和pPVP2-ORF2．S。经插入方向鉴定正确后，KpnI、BamHI和ApaLI三酶切质粒pPVP2-ORF2．H和pPVP2-ORF2．S，回收含VP2基因和ORF2基因的目的片段并将重组基因分别连接到含绿色荧光蛋白基因的真核表达载体（pEGFP-C1），得到重组质粒pEGFP．VO．H和pEGFP．VO．S。脂质体转染系统转染Cos7细胞，倒置荧光显微镜观察重组基因表达情况。再将绿色荧光明显的Cos7细胞制备电镜样品。将pEGFP．VO．H和pEGFP．VO．SDNA免疫健康小白鼠，并设立pEGFP-VP2 DNA、pEGFP-ORF2 DNA、pEGFP-C1DNA、猪细小病毒普通疫苗、猪圆环病毒弱毒及生理盐水空白等6个对照组。断尾采血并检测血中T淋巴细胞的动态变化，以及血清中PPV、PCV2抗体变化。结果显示：真核重组表达质粒pEGFP．VO．H和pEGFP．VO．S构建成功：两个重组质粒均能在Cos7细胞中表达出大量荧光；电镜切片中，转染有重组质粒pEGFP．VO．H的样品中观察到了病毒样颗粒，而转染有重组质粒pEGFP．VO．S的样品中没有观察到病毒样颗粒；重组质粒pEGFP．VO．H DNA免疫小白鼠后，CD3+T淋巴细胞在外周血淋巴细胞中的比率均有一定程度的升高，而CD4+、CD8+T淋巴细胞在免疫后7-14d时有所下降之后再升高，而重组质粒pEGFP．VO．S DNA免疫小白鼠后，CD3+T淋巴细胞在外周血淋巴细胞中的比率均也有有所升高，CD4+淋巴细胞在免疫后7-14d时有所下降之后再升高，CD8+T淋巴细胞则没有升高；同时从血清中检测出较高水平的PPV、PCV2特异性抗体。研究结果表明：在PPV VPLs的N端1／3处插入PCV ORF2抗原多肽并不影响其正确形成病毒样颗粒的能力，且能同时诱导产生高水平的抗PPV和PCV2特异性抗体；而VPLs的C端1／3处则不适合抗原表位的插入。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 前言
• 1.猪细小病毒VP2基因及其编码蛋白的研究进展
• 2.猪圆环病毒2型ORF2基因及其编码蛋白的研究进展
• 3.病毒样颗粒的研究进展
• 4.实验目的及意义
• 实验部分
• 1.材料
• 1.1实验材料
• 1.2主要仪器
• 2.方法
• 2.1 PPV VP2基因的PCR、克隆及鉴定
• 2.1.1 PPV VP2基因的引物设计及合成
• 2.1.2 PPV病毒基因组DNA的提取
• 2.1.3 PPV VP2基因的PCR
• 2.1.4 目的基因的回收
• 2.1.5 VP2基因的克隆及鉴定
• 2.2 PCV2 ORF2基因的PCR、克隆及鉴定
• 2.2.1 PCV2 ORF2基因的引物设计
• 2.2.2 质粒pPI-2.EGFP.VP2.ORF2的抽提
• 2.2.3 ORF2基因的PCR
• 2.2.4 ORF2基因的回收
• 2.2.5 ORF2基因的克隆及鉴定
• 2.3 含PPVVP2基因和PCV2 ORF2基因的重组质粒载体的构建
• 2.3.1 PCV2 ORF2 DNA的获得
• 2.3.2 含PPV VP2基因的pMD18-T Simple开环载体的准备
• 2.3.3 PPV VP2基因和PCV2 ORF2基因的连接及转化
• 2.3.4 重组质粒的鉴定
• 2.4 含PPVVP2、PCV2 ORF2基因和绿色荧光蛋白基因表达载体质粒（pEGFP.VO.H和pEGFP.VO.S）的构建
• 2.4.1 VP2-ORF2（H）和VP2-ORF2（S）基因片段的酶切回收
• 2.4.2 质粒pEGFP-C1酶切回收
• 2.4.3 连接与转化
• 2.4.4 pEGFP.VO.H和p.EGFP.VO.S重组质粒载体的鉴定
• 2.5 PEGFP.VO.H和PEGFP.VO.S质粒DNA转染Cos7细胞
• 2.5.1 去内毒素的质粒pEGFP.VO.H和pEGFP.VO.S DNA的抽提
• 2.5.2 pEGFP.VO.H和pEGFEVO.S质粒DNA的转染
• 2.6 超薄切片电镜观察
• 2.7 VLPs的免疫原性
• 2.7.1 pEGFP.VO.H和pEGFP.VO.S质粒DNA的大量抽提与纯化
• 2.7.2 质粒DNA的免疫
• 2.7.3 血样的采集
• 2.7.4 T淋巴细胞数量的动态变化检测
• 2.7.5 PPV抗体检测
• 2.7.6 PCV2抗体检测
• 3.结果与分析
• 3.1 PMD-VP2的构建
• 3.1.1 PPV VP2基因的PCR扩增
• 3.1.2 PCR及酶切鉴定
• 3.1.3 序列测定
• 3.2 PMD-ORF2的构建
• 3.2.1 PCV2 ORF2基因的PCR扩增
• 3.2.2 酶切鉴定
• 3.3 重组质粒PPVP2-ORF2.H和PPVP2-ORF2.S的构建
• 3.3.1 重组质粒的PCR鉴定
• 3.3.2 重组质粒的单酶切鉴定
• 3.3.3 ORF2基因的插入方向鉴定
• 3.3.4 重组质粒的序列测定
• 3.4 含PPVVP2、PCV2ORF2基因和绿色荧光蛋白基因表达载体质粒（PEGFP.VO.H和PEGFP.VO.S）的构建
• 3.4.1 PCR鉴定
• 3.4.2 双酶切鉴定
• 3.5 PEGFP.VO.H和PEGFP.VO.S质粒DNA转染Cos7细胞的荧光观察
• 3.6 超薄切片电镜观察
• 3.7 VLPs的免疫原性研究
• 3.7.1 接种后小白鼠的临床表现
• 3.7.2 T淋巴细胞数量的动态变化检测
• 3.7.3 PPV抗体检测
• 3.7.4 PCV2抗体检测
• 4.讨论
• 4.1 目的基因的选择
• 4.2 真核表达载体的选择
• 4.3 真核表达质粒的构建
• 4.4 重组质粒的转染
• 4.5 重组质粒的表达情况
• 4.6 重组质粒的免疫原性
• 4.6.1 细胞免疫
• 4.6.2 体液免疫
• 5.结论
• 参考文献
• 致谢
• 附录