通过叶绿体基因工程在转基因植物中合成中长链羟基脂肪酸聚酯（mcl-PHAs）

论文题目: 通过叶绿体基因工程在转基因植物中合成中长链羟基脂肪酸聚酯（mcl-PHAs）

论文类型: 博士论文

论文专业: 生物化学与分子生物学

作者: 王玉华

导师: 杨清,黄丛林

关键词: 中长链羟基脂肪酸聚酯,叶绿体基因工程,植物生物反应器,转基因烟草,母性遗传,叶绿体同源片段,甘薯

文献来源: 南京农业大学

发表年度: 2005

论文摘要: 羟基脂肪酸聚酯（polyhydroxyalkanoates，PHAs）属于微生物聚酯，在生物体内主要作为细胞内碳源和能源的贮藏性物质存在，它不但具有与化学合成塑料相似的物理、机械特性，而且具有完全的生物可降解性和良好的生物相容性，被认为是石油化工聚酯的理想替代品。中长链羟基脂肪酸聚酯（medium-chain-length-PHAs，mcl-PHAs）是几种中长链的羟基脂肪酸结构单体的共聚物，比短链羟基脂肪酸聚酯（short-chain-length-PHAs，scl-PHAs）具有更好的物理、机械特性。微生物发酵法生产的PHAs价格过高，无法在市场上与石油化工聚酯竞争。随着分子生物学的发展，人们逐渐将视线转向转基因植物，将细菌中的PHAs合成途径引入植物，利用植物作为生物反应器生产PHAs。 高等植物叶绿体基因工程是植物基因工程发展的新领域，是近十年才开始兴起的一种新的转基因途径，具有传统核转化技术所不具备的独特魅力，已经成为植物基因工程领域研究的热点，因而自问世以来迅速在基础研究和实践应用等方面显示出旺盛的生命力，尤其在以叶绿体为生物反应器合成目标产物方面应用广泛。 本研究通过PCR方法从水稻叶绿体基因组中克隆了叶绿体基因psbA的启动子和终止子以及rbcL基因的3’-端调控序列；从烟草叶绿体基因组中克隆了psbA基因的3’-端调控序列和两段叶绿体同源片段。以aadA（编码氨糖苷-3’-磷酸转移酶）基因做筛选标记，分别构建了含phaC2基因的单价叶绿体遗传转化表达载体pTC2以及同时嵌合phaC和phaG基因的双价叶绿体遗传转化表达载体pTGC，基因枪转化法转化烟草，获得具有壮观霉素（Spectinomycin，Spc）抗性的转pTC2的阳性植株5个、转pTGC的阳性植株6个。对T0代和T1代转基因烟草的PCR和Southern blot鉴定结果表明，外源基因确已整合进烟草叶绿体基因组中，T1代转基因植株已完全达同质化。RT-PCR分析结果证实aadA和phaC基因已在转录水平上表达。转基因植株的正反交试验证明外源基因在转基因烟草后代中遵循母性遗传规律，不存在转基因的花粉漂移现象。气相色谱法检测转基因株系中的mcl-PHAs含量最高达4.8mg/g干重（株系S4-3），合成的mcl-PHAs单体主要成分为3-羟基辛酸（3-hydroxyoctanoate，3-HO）和3-羟基癸酸（3-dydroxydecanoate，3-HD）。只转化phaC2基因的叶绿体型转基因烟草基本检测不到有mel-PHAs合成，共表达phaC和phaG基因的叶绿体型转基因烟草则能合成相对较高水平的mcl-PHAs。透射电镜观察到转基因烟草叶绿体中确有

论文目录:

中文摘要

英文摘要

第一部分 文献综述

第一章 羟基脂肪酸聚酯研究进展

第一节 PHAs简介

第二节 PHAs在自然寄主中的生物合成、解聚及其分子机制

第三节 PHAs的应用

第四节 PHAs的生产

第五节 利用转基因植物生产PHAs遇到的问题和今后的发展方向

第二章 叶绿体基因工程研究进展

第一节 叶绿体基因组研究概况

第二节 叶绿体基因工程简介

第三节 叶绿体基因工程的应用

第四节 叶绿体基因工程存在的问题与解决策略

第五节 叶绿体基因工程的前景展望

第二部分 通过叶绿体基因工程在烟草中合成中长链羟基脂肪酸聚酯

第一章 前言

第二章 材料与方法

1 试验材料和试剂

1.1 材料

1.2 主要分子生物学试剂

1.3 主要仪器

2 试验方法

2.1 植物叶绿体DNA的提取

2.2 叶绿体基因启动子、终止子和同源片段的PCR扩增

2.3 DNA片段的回收(按V-gene DNA凝胶回收试剂盒说明书进行)

2.4 CaCl_2法制备大肠杆菌感受态

2.5 PCR产物的克隆

2.6 质粒 DNA的提取

2.7 质粒 DNA的酶切验证

2.8 DNA测序

2.9 叶绿体转化表达载体的构建

2.10 质粒DNA的大量提取

2.11 PEG法纯化质粒DNA

2.12 基因枪法转化烟草叶片

2.13 CTAB法提取烟草基因组总DNA

2.14 叶绿体型转基因植株的 PCR检测

2.15 转基因烟草的Southern blot检测

2.16 转基因植株的RT-PCR检测

2.17 外源基因在转基因烟草中的遗传分析

2.18 气相色谱法检测转基因烟草中的mcl-PHAs

2.19 透射电镜观察mcl-PHAs颗粒在叶绿体中的积累

第三章 结果与讨论

1 结果

1.1 叶绿体表达载体的构建和鉴定

1.2 基因枪转化及转基因烟草的获得

1.3 转基因烟草的PCR检测

1.4 转基因烟草的Southern blot分析

1.5 外源基因在叶绿体基因组中的整合及同质化程度鉴定

1.6 转基因烟草的RT-PCR分析

1.7 外源基因在叶绿体型转基因烟草中遵循母性遗传规律

1.8 转基因烟草中的mcl-PHAs含量分析

1.9 透射电镜观察转基因植株叶片叶绿体中的mcl-PHAs颗粒

2 讨论

2.1 利用脂肪酸β-氧化的中间产物在转基因烟草叶绿体中合成mcl-PHAs

2.2 利用植物脂肪酸生物合成途径的中间产物合成mcl-PHAs

2.3 mcl-PHAs的积累对烟草叶绿体结构的影响

2.4 转基因烟草中合成的mcl-PHAs单体组成

2.5 PHAs的合成和积累对转基因烟草生长发育的影响

2.6 关于叶绿体基因工程

小结

第三部分 甘薯叶绿体表达载体的构建及PHAC/GFP融合基因在甘薯和烟草叶绿体中的瞬间表达

第一章 前言

第二章 材料和方法

1 材料

1.1 植物材料

1.2 菌种和质粒

1.3 主要分子生物学试剂

1.2 主要仪器

2 方法

2.1 植物叶绿体 DNA的提取

2.2 甘薯叶绿体同源片段的克隆

2.3 扩增片段的克隆及酶切图谱分析

2.4 甘薯叶绿体表达载体的构建和酶切验证

2.5 质粒 DNA的大量提取和纯化

2.6 基因枪法转化甘薯和烟草叶片

2.7 荧光显微镜观察

第三章 结果与讨论

1 结果

1.1 两段甘薯叶绿体DNA片段的扩增

1.2 两段甘薯叶绿体DNA片段的序列分析

1.3 甘薯叶绿体同源片段的酶切图谱

1.4 甘薯叶绿体rbcL与accD基因间序列的扩增与分析

1.5 甘薯叶绿体定点整合表达载体的构建

1.6 基因枪法转化植物叶绿体

1.7 PHAs合酶/GFP融合蛋白在叶绿体中的瞬间表达

2 讨论

2.1 开展甘薯叶绿体基因工程

2.2 叶绿体转化机理的探索

2.3 GFP报告基因可以应用于叶绿体基因工程

小结

全文讨论

全文结论

本研究的创新点

参考文献

附录

攻读博士学位期间发表的学术论文

致谢

发布时间: 2006-10-20

参考文献

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