生防木霉菌与水稻共生体的建立及其关系研究

论文摘要

植物可通过根部与土壤中的微生物,建立植物—微生物系统,进行代谢产物的交换,激活植物的防御机理,影响植物的生长。本论文为探明生防木霉菌与水稻互作关系及作用,通过对木霉菌敏感药剂的筛选,确定了三唑类化学杀菌剂腈菌唑作为木霉菌抗药性遗传标记筛选药剂,同时,确定了木霉菌抗药性遗传改良的紫外线诱变剂量与腈菌唑复筛药剂浓度。在此基础上,利用紫外线与腈菌唑协同诱变技术对本实验室自行筛选的优良生防木霉菌T2-16进行遗传改良,通过三年多时间的诱变改造,共筛选出106株抗药性木霉菌突变体,利用对水稻主要病原菌的拮抗作用,从中选育出既对腈菌唑药物具有较强的抗性又保持优良拮抗性的木霉菌突变体TUV-13。经与出发菌株的培养性状、乙酸乙酯提取物成分与含量、在水稻植株定殖能力、遗传稳定性等生物学特征的比较,证明TUV-13是具有明显双抗遗传标记木霉突变型菌株,可作为研究木霉菌大田条件下与水稻互作共生体关系的标记菌株。此外,利用RAPD-PCR分子标记技术检测了突变体与其出发菌株的DNA多态性,佐证了紫外线与腈菌唑协同诱变主要是通过其遗传物质DNA位点突变而实现的。为生防木霉菌抗药性改良提供一套稳定的技术,拓宽了木霉菌大田推广应用范围。为探明木霉菌TUV-13浸种处理水稻种子后,在大田生产条件下能否在水稻根际与其他器官定殖,与水稻形成共生体,通过对两地不同品种不同栽培模式的有关纹枯病发生发展、抗病相关酶活力、水稻生长势等因素的变化动态调查,结果确定了木霉菌与水稻形成机遇性共生体过程及动态,即通过浸种接种方式,木霉菌可随着水稻生长发育,定殖于水稻植株整个器官的表面及皮层细胞间隙。在秧苗期可增殖,但随着水稻进一步发育生长,定殖的木霉菌数量却越来越少。到了水稻生殖生长阶段,急剧降低。整个水稻生育期,木霉菌定殖动态呈现出前升后降,后期消失的动态规律;木霉菌与水稻的这种共生体关系,可诱导水稻植株抗病相关的PPO、POD、PAL酶活力提高,增强水稻对其主要病害的抗病性。尤其明显的是能够增强水稻秧苗素质、促进分蘖抽穗,最终明显提高水稻产量。此外,田间秧苗抗寒性与水稻纹枯病发生发展调查表明,木霉菌与水稻共生体关系还能增强秧苗的抗寒能力,对水稻纹枯病防治效果呈现前高中低后高的马鞍型动态规律。为进一步探明木霉菌与水稻形成共生体关系的机制,在室内盆栽仅有木霉菌与水稻的条件下,采用木霉菌孢悬液浸种、沾根和叶面接种等3种方法,观察木霉菌在水稻植株上如何侵入、定殖与转移动态。结果表明,浸种处理是木霉菌与水稻形成系统共生体关系的最有效方法,而蘸根、叶部接种处理只能使木霉菌与水稻形成局部的共生体关系。不同木霉菌株浸种处理结果确定了木霉菌与水稻形成共生体的机制为:木霉菌可吸附在水稻颖壳表面,随着种子萌发,通过产生附着孢、缠绕等方式吸附在水稻胚根、胚芽以及两者之间的隆起组织,并克服水稻的防御机制,主动侵入水稻各组织器官皮层细胞间隙,并随着植株的生长而扩展。其中,水温、浸种时间的长短可影响木霉菌在水稻植株中定殖。木霉菌与水稻共生体中存在游离氨基酸的交换。还能诱导水稻秧苗对纹枯病抗病性。系统溶剂法提取试验结果表明,氯仿是木霉菌TUV-13水稻体外模拟培养物抗菌物质提取的最适溶剂。GC-MS检测到TUV-13氯仿提取物有40多种化学成分,其中烷烃类数量最多,为13种,其他成分为有机酸类、酯类、酮类、类固醇类等有机化合物。大孔吸附树脂HP-20与硅胶柱层析分离试验结果确定石油醚乙酸乙酯作洗脱剂的硅胶柱层析系统是木霉菌YUV-13抗菌物质的最适分离方法,能有效地分离出3种结构不同的抗菌物质。其中2号流分抗菌活性最强,鉴定为十八碳二烯酸甲酯,9号流分次之,鉴定为类固醇类抗生素。室内体外细胞毒力测定,木霉菌TUV-13代谢产生的十八碳二烯酸甲酯对不同病原菌抑制效果具有明显差异,其中对水稻纹枯病菌最为敏感,EC50值9.27μg/mL;对花生白绢病EC50值为21.53μg/mL;对辣椒疫病EC50为131.48μg/mL;对水稻稻瘟病EC50为428μg/mL。同时对不同水稻品种种子活力还具有促进作用

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 第一章 绪论
• 1 木霉菌生物防治及其微生态学研究进展
• 1.1 木霉菌的地理分布及其种群
• 1.2 木霉菌与植物病害的微生态调控
• 1.2.1 微生态调控的概念
• 1.2.2 木霉菌在土壤及寄主植物上的定殖
• 1.2.3 木霉菌在植物的定殖机制
• 2 抗药性木霉菌突变体研究进展
• 2.1 获得抗（解）药性木霉菌株的方法
• 2.1.1 定向筛选
• 2.1.2 诱变
• 2.1.3 原生质体融合
• 2.1.4 基因工程育种
• 3 选题依据、目的与意义
• 4 论文主要研究内容
• 第二章 双抗木霉菌突变体选育及生物学特性研究
• 1 材料、试剂和仪器
• 1.1 实验材料
• 1.2 试剂及溶液的配制
• 1.3 实验仪器
• 2 实验方法
• 2.1 对木霉菌细胞毒力敏感化学杀菌剂药剂的筛选
• 2.1.1 供试化学杀菌剂的配制及其对木霉菌毒力预试验
• 2.1.2 不同杀菌剂对木霉菌菌丝细胞毒力的测定
• 2.2 抗药性标记木霉菌株选育
• 2.2.1 紫外线诱变剂量的确定
• 2.2.2 紫外线诱变与耐药性突变型菌株初筛方法
• 2.2.3 抗药性标记木霉突变体的复筛
• 2.3 双抗木霉突变体筛选
• 2.3.1 拮抗性优良的抗药木霉突变体筛选
• 2.3.2 高产抗菌物质的抗药性木霉突变体的筛选
• 2.4 原始菌株与双抗木霉菌突变体生物学特性比较
• 2.4.1 形态比较
• 2.4.2 乙酸乙酯提取物成分比较分析
• 2.4.3 用RAPD方法检测突变体菌株DNA变异程度
• 2.5 最优双抗木霉突变体遗传稳定性研究
• 2.5.1 PDA斜面保藏的菌种抗药性稳定性
• 2.5.2 无药PDA平板和含药PDA平板连续培养对木霉突变体抗药性的影响
• 2.6 双抗木霉突变体在水稻植株定殖能力研究
• 2.6.1 供试木霉菌株孢子悬浮液的制备
• 2.6.2 水稻种子的处理
• 2.6.3 木霉菌浸种后水稻体内木霉菌的分离
• 3 结果与分析
• 3.1 木霉菌敏感药剂的确定
• 3.2 抗药性木霉菌株的选育结果
• 3.2.1 紫外光对木霉菌致死率与剂量确定
• 3.2.2 抗药性木霉突变体的诱变与筛选结果
• 3.3 双抗木霉菌突变株选育结果
• 3.3.1 木霉突变体对水稻主要病原菌拮抗能力比较结果
• 3.3.2 木霉突变体抗菌活力的比较结果
• 3.4 双抗木霉突变体与原始菌株生物学特性比较结果
• 3.4.1 培养性状比较
• 3.4.2 主要抗菌物质成分比较
• 3.4.3 遗传多态性分析
• 3.5 双抗木霉菌突变体TUV-13在水稻体内的定殖能力
• 3.6 双抗木霉菌突变体TUV-13遗传稳定性
• 3.6.1 低温保藏对抗药性突变体遗传稳定性的影响
• 3.6.2 含药和不含药PDA培养基连续培养对TUV-13抗药性稳定性的影响
• 4 小结与讨论
• 4.1 小结
• 4.2 讨论
• 4.2.1 抗药性生防木霉菌选育的必要性与方法
• 4.2.2 筛选药剂及其浓度的选择
• 4.2.3 木霉菌抗药性形成机制
• 第三章 双抗木霉菌TUV-13在田间与水稻共生动态及功效研究
• 1 材料、试剂
• 1.1 实验材料
• 1.2 仪器
• 2 实验方法
• 2.1 双抗木霉菌株在田间水稻定殖动态研究
• 2.1.1 双抗木霉菌孢子悬浮液的制备
• 2.1.2 水稻种子处理、秧苗培育及田间种植
• 2.1.4 田间生长条件下,双抗木霉菌不同生育期在水稻植株体内定殖转移动态的调查与统计方法
• 2.2 共生木霉菌对水稻秧苗素质及其抗寒性的影响
• 2.2.1 共生木霉菌对水稻秧苗素质的影响
• 2.2.2 共生木霉菌对水稻抗寒性的影响
• 2.3 共生木霉菌对水稻生长势及其产量的影响
• 2.4 共生木霉菌对水稻抗病相关蛋白酶变化动态的影响
• 2.4.1 苯丙氨酸解氨酶（PAL）酶液的制备和测定
• 2.4.2 过氧化物酶（PO）和多酚氧化酸（PPO）
• 2.5 共生木霉菌对田间水稻纹枯病发生发展动态的影响
• 2.6 黄兴镇试验点田间小区各因子典范对应分析
• 3 结果与分析
• 3.1 双抗木霉菌TUV-13在水稻不同生育期植株体内定殖转移动态
• 3.2 共生木霉菌对水稻秧苗素质的影响结果
• 3.2.1 共生木霉菌对水稻秧苗生长势的影响
• 3.2.2 共生木霉菌对水稻秧苗抗寒性及其相关生理生化指标的影响
• 3.3 共生木霉菌对水稻抗病相关酶活性影响的结果
• 3.4 共生木霉菌对水稻纹枯病田间发生动态的影响及其防效
• 3.5 对水稻植株生长势及产量的影响结果
• 3.6 不同处理小区各生物因子典范对应分析
• 3.6.1 水稻全生育期不同处理小区各生物因子典范对应分析
• 3.6.2 水稻苗期不同处理小区典范对应分析
• 3.6.3 水稻分蘖期不同处理小区典范对应分析
• 3.6.4 水稻抽穗期不同处理小区典范对应分析
• 3.6.5 水稻黄熟期不同处理小区典范对应分析
• 4 小结与讨论
• 4.1 小结
• 4.2 讨论
• 4.2.1 木霉菌定殖水稻植株的主要功效及机理
• 4.2.2 木霉菌对水稻大田生产主要病害生态防治的效果评价
• 第四章 木霉菌在水稻体内的定殖机制研究
• 1 材料、试剂
• 1.1 实验材料
• 1.2 试剂
• 1.3 仪器
• 2 实验方法
• 2.1 不同接种方法对TUV-13在水稻植株体表、体内定殖扩展的影响
• 2.1.1 不同接种方法TUV-13在水稻定殖扩展的检测
• 2.1.2 TUV-13定殖水稻秧苗的组织结构
• 2.2 不同木霉菌株在水稻体内定殖情况检测
• 2.2.1 供试木霉菌及其孢子悬浮液的制备
• 2.2.2 水稻种子处理
• 2.2.3 木霉菌的分离回收
• 2.3 影响TUV-13在水稻体内定殖扩展因素检测
• 2.3.1 浸种时间对TUV-13在水稻体内定殖的影响
• 2.3.2 生长温度对TUV-13在水稻体内定殖的影响
• 2.4 TUV-13与共生水稻植株游离氨基酸的检测
• 2.4.1 TUV-13和其寄主水稻的培育
• 2.4.2 TUV-13菌丝体中游离氨基酸的测定
• 2.4.3 水稻植株中游离氨基酸的测定
• 2.5 TUV-13诱导水稻秧苗抗病性研究
• 3 结果与分析
• 3.1 不同接种方法TUV-13在水稻定殖的测定结果
• 3.1.1 不同接种方法TUV-13在水稻秧苗定殖扩展测定
• 3.1.2 TUV-13定殖水稻组织结构显微观察结果
• 3.2 不同木霉菌浸种处理水稻及其定殖情况检测结果
• 3.2.1 不同木霉菌株对水稻侵染的确定
• 3.3 影响木霉菌在水稻体内定殖的因素
• 3.4 内生木霉菌菌丝体和水稻植株中游离氨基酸的种类和含量的比较
• 3.5 TUV-13对水稻抗病性研究结果
• 4 小结与讨论
• 4.1 小结
• 4.2 讨论
• 4.2.1 木霉菌与水稻共生体关系的生态学定义
• 4.2.2 木霉菌与水稻共生体关系的机遇性及其影响因素
• 第五章 TUV-13抗菌代谢产物分离与鉴定
• 1 材料与仪器
• 1.1 供试菌株与水稻种子
• 1.2 主要实验仪器
• 2 实验方法
• 2.1 TUV-13水稻体外模拟培养基配方及发酵产物制备
• 2.2 TUV-13抗菌物质的提取溶剂筛选
• 2.3 TUV-13粗体物抑菌谱测定与敏感菌株筛选
• 2.4 TUV-13氯仿提取物成分GC-MS分析
• 2.5 TUV-13抗菌物质分离与结构鉴定
• 2.5.1 分离条件的选择
• 2.5.2 抗菌活性物质分离
• 2.5.3 抗菌活性物质成分鉴定
• 2.6 主要抗菌活性物质的生物学活性检测
• 2.6.1 对不同病原菌EC50值检测
• 2.6.2 对不同水稻品种种子活力检测
• 3 结果与分析
• 3.1 TUV-13不同极性代谢产物提取溶剂的确定
• 3.2 TUV-13抑菌谱测定与敏感病原菌的筛选结果
• 3.3 TUV-13氯仿提取物化学成分分析结果
• 3.4 TUV-13抗菌物质分离条件的确定
• 3.5 抗菌物质的分离结果
• 3.6 2号流分抗菌活性物质结构鉴定结果
• 3.7 9号流分抗菌活性物质分离与结构鉴定
• 3.8 TUV-13主要抗菌物质生物学活性研究结果
• 3.8.1 主要抗菌物质抑菌谱测定
• 3.8.2 主要抗菌物质对不同水稻品种种子活力影响的结果
• 4 小结与讨论
• 4.1 小结
• 4.2 讨论
• 4.2.1 木霉菌抗菌物质与应用
• 第六章 结果与展望
• 1 结论
• 2 主要创新点
• 3 讨论与延续性工作计划
• 3.1 内生木霉菌与水稻机遇性共生体关系的定义与研究方法
• 3.2 提高生防木霉菌对水稻主要病害生态防治效果的途径与意义
• 参考文献
• 版图
• 致谢
• 作者简介