卤虫休眠卵壳形成的分子机制及其抗逆功能的研究

论文摘要

卤虫（丰年虾）是一种常见于高原盐湖、海滨盐场等高盐环境的小型甲壳类动物。由于其特殊的生殖方式和惊人的抗逆能力目前已成为逆境生物学研究的热点之一。也正是因为这种特殊的生存方式,才让这个弱小的物种在超过4亿年的演变进化进程中延续下来。卤虫有卵胎生（ovoviviparity）和卵生（oviparity）两种迥异的生殖途径,既可直接产下幼虫,也可产下包被着坚硬外壳的休眠卵。当生存环境条件恶化时,卤虫采用卵生的方式产下后代以延续自己的种群。这种休眠卵可以忍受长期干旱、缺氧、炎热、冷冻、高盐脱水、紫外辐射等极端环境的考验,以度过漫长的旱季和冬季;一旦环境条件合适,可以很快从休眠状态中复苏,继续发育成幼虫。之前的研究表明,卤虫卵的抗逆能力很大程度上来源于其非细胞的外壳,而该外壳的具体成分和形成机制目前尚不清楚。首先,我们通过抑制性消减杂交的方法,从cDNA消减文库中筛选到一个与卤虫卵壳形成密切相关的基因,命名为泌壳腺特异性表达基因（ShellGland-specifically Expressed Gene,SGEG）,并通过cDNA末端快速克隆（RACE）的方法获得了该基因的全序列。SGEG基因cDNA长450bp,具有345bp的开放阅读框（ORF）,其翻译的多肽经预测由33个氨基酸残基的信号肽和81个氨基酸残基的成熟肽组成。在DDBJ/EMBL/GenBank等数据库中进行各种Blast比对,没有发现任何同源的核酸和蛋白序列。第二,我们对SGEG基因的表达特征进行了检测分析。Northern blotting结果显示该基因仅表达于卵生途径的卤虫卵囊中,在卵细胞从卵巢中排出进入侧囊时进入表达高峰期,随后逐渐下降,并在下一个生殖周期卵巢排卵时再次达到高峰,呈现有规律的周期性变化。原位杂交结果精确地显示了该基因仅在泌壳腺细胞中特异性表达。第三,为了研究SGEG基因的功能,我们采用RNA干涉的方法敲除了该基因,并同时从核酸和蛋白两个方面检测了干涉效率。SGEG基因沉默的卤虫成虫没有出现异常,但其产下的休眠卵发生了巨大的变化。干涉后产下的卵全部沉在培养箱底部,外壳变得柔软且具有弱粘性。通过解剖镜和倒置显微镜观察,干涉卵的卵壳呈现透明的淡黄色而不是正常的褐色,可以清晰看见内部的胚胎。扫描电子显微镜和透射电子显微镜的结果显示,干涉卵的卵壳表面变得粗糙且呈现出片层状,整个壳层变得疏松,电子透射率大幅上升。另外,卵壳皮质层的厚度减小,其内部的荚孔也变得模糊而紊乱。我们同时检测了干涉卵中常见金属元素的变化,结果显示铁元素的含量减少非常显著,同时钾元素含量显著上升。伴随着卵壳的变化,干涉卵在生理上也出现了异常,主要表现为不需要活化过程就可以直接孵化,具有超过20%的孵化率。SDS-PAGE结果显示,在SGEG基因被敲除后,干涉卵总蛋白发生了明显的变化。根据蛋白条带的分子量,我们认为其中卵黄蛋白、artemin和p26明显减少,而p49等蛋白显著上升。根据这些结果我们推测干涉卵的休眠状态并不彻底,在合适的环境中相对容易打破休眠而恢复发育。最后,我们对干涉导致的休眠卵进行了抗逆性测试,发现缺乏SGEG蛋白的休眠卵丧失了原有的抗逆能力。包括对干燥、高温、冷冻、渗透压、紫外辐射和有机溶剂等胁迫的抗性,而这些胁迫对正常卵几乎不产生任何影响。综上所述,我们认为SGEG基因在卤虫卵壳形成过程中体现了非常重要的功能。本研究不仅给卤虫卵壳形成过程、卤虫卵抗逆机制等研究领域提供了数据,也为进一步深入揭示极端环境生物的抗逆机理奠定了基础。

论文目录

• 致谢
• 前言
• 摘要
• Abstract
• 常用缩略词表
• 目录
• 第一章 绪论
• 1 尕海与尕海孤雌生殖卤虫（Artemia parthenogenetica）
• 2 卤虫特殊的生殖系统和生殖方式
• 3 卤虫的休眠胚胎
• 4 卤虫休眠卵抗逆性的分子机制
• 4.1 海藻糖
• 4.2 p26及其它热激蛋白
• 4.3 Artemin
• 5 卤虫休眠卵壳的结构与成分
• 6 卤虫休眠卵壳的功能
• 7 展望
• 参考文献
• 第二章 卤虫养殖与抑制性消减杂交
• 1 引言
• 2 材料和仪器
• 2.1 实验材料
• 2.2 实验试剂
• 2.3 主要实验仪器
• 3 实验方法
• 3.1 卤虫生殖体节总RNA的抽提
• +RNA的提取'>3.2 卤虫生殖体节PolyA⁺RNA的提取
• 3.3 卵生/卵胎生卤虫生殖体节SSH cDNA文库的建立
• 3.4 SSH cDNA文库的筛选
• 3.5 表达差异性确认
• 4 实验结果
• 4.1 插入片段检测
• 4.2 点杂交筛选结果
• 4.3 测序结果分析
• 4.4 表达差异性确认
• 5 讨论
• 参考文献
• 第三章 SGEG的序列分析与表达特征
• 1 引言
• 2 材料和仪器
• 2.1 实验材料
• 2.2 实验试剂
• 2.3 主要实验仪器
• 3 实验方法
• 3.1 cDNA末端快速扩增（RACE）
• 3.2 序列分析
• 3.3 Northern blotting检测SGEG基因的表达位置和时序
• 3.4 原位杂交确认SGEG基因表达位点。
• 4 实验结果
• 4.1 SGEG基因及其推导的蛋白的序列分析
• 4.2 Northern blotting分析SGEG mRNA的表达特征。
• 4.3 原位杂交
• 5 讨论
• 参考文献
• 第四章 SGEG的功能分析
• 1 引言
• 2 材料
• 2.1 实验材料
• 2.2 实验试剂
• 2.3 主要实验仪器
• 3 实验方法
• 3.1 RNA干涉
• 3.2 干涉效率检测
• 3.3 电子显微镜及冷谱
• 3.4 SDS-PAGE分析
• 3.5 孵化率和胁迫耐受性实验
• 4 实验结果
• 4.1 RNA干涉注射量的选择
• 4.2 干涉效率检测
• 4.3 干涉结果的观察
• 4.4 干涉后休眠卵元素的变化
• 4.5 SDS-PAGE分析结果
• 4.6 孵化率实验和胁迫实验结果
• 5 讨论
• 参考文献
• 结论
• 附录一 常用试剂配制一览表
• 附录二 引物清单
• 附录三 作者简历