论文摘要
虾青素因其特殊的着色功能、抗氧化性、抗肿瘤以及增强免疫力等生物学功能,在水产养殖、医疗保健和食品等领域有着广泛的应用。法夫酵母是合成天然虾青素的主要微生物之一,但目前大多数菌株的生产水平无法满足规模化的生产需要。为了进一步了解法夫酵母菌株的代谢特征,通过代谢调控手段来提高法夫酵母合成虾青素的产量,本文主要做了以下几方面的研究:首先,对比研究了实验室选育保藏的四株法夫酵母菌株的发酵特性,并考察了法夫酵母菌株生长代谢和虾青素合成之间的关系,实验结果发现:法夫酵母JMU-17W菌株耗糖量大,菌体生长旺盛,虾青素产量低;法夫酵母JMU-7B12和JMU-VDL668菌株的虾青素产量较低,细胞产率为0.3-0.5 mg/g左右,发酵过程中克雷布特里效应明显,会产生大量的乙醇等代谢副产物;以JMU-VDL668为出发菌株经诱变筛选得到的JMU-MVP14菌株是一种低耗糖,生长缓慢,高产虾青素的菌株,单位类胡萝卜素细胞产率可达6.8 mg/g,在7 L罐中的分批发酵,虾青素产量达到了116.86 mg/L,且含有大量的其他类胡萝卜素成分。同时研究发现,法夫酵母虾青素合成与细胞物质的合成具有紧密的联系:生长过程中,在发酵前期胞内虾青素含量的变化与蛋白质、脂肪酸含量的变化趋势相反;而在稳定期虾青素和脂肪酸含量表现出同步增长趋势;对比四株产虾青素菌株的生长代谢状况,可以发现高产虾青素菌株JMU-MVP14菌体蛋白质和脂肪酸含量较低,而虾青素的细胞产量最大。其次,考察几种发酵促进剂对法夫酵母的生长代谢和虾青素合成的影响,结果表明在培养基中添加丙酮酸、乳酸和柠檬酸后,法夫酵母JMU-VDL668和JMU-MVP14菌株耗糖量明显增加,生物量、虾青素产量和脂肪酸含量均有提高,而蛋白质的合成受到一定的抑制;对法夫酵母JMU-MVP14菌株而言,添加丙酮酸、乳酸和柠檬酸后虾青素细胞产率明显降低,添加甘油和乙醇后,蛋白质、脂肪酸和虾青素细胞产率均升高,但生物量降低;经优化,在法夫酵母JMU-MVP14菌株发酵过程中于接种后0 h添加2 g/L的丙酮酸比较有利于菌体生长和虾青素的生产,生物量和虾青素产量分别达到了7.65 g/L和46.79 mg/L;于接种后96 h添加1 g/L的乙醇对虾青素的细胞产率提高较明显,达到7.43 mg/g,比空白组提高了32%。最后,对虾青素高产菌株法夫酵母JMU-MVP14罐上发酵pH条件进行优化并尝试了几种分批补料工艺,结果表明:7 L罐分批培养的pH恒定控制在5.0时,虾青素的产量、虾青素得率以及合成速度均为最大,分别为Pmax=138.38 mg/L、Yp/s=2.90 mg/g和rp=1.526mg/（L·h）;且较高pH条件下有利于β-隐黄质和β-胡萝卜素的合成,而较低pH条件有利于虾青素的合成,pH为3.0和4.0时虾青素的细胞产率分别达到8.25 mg/g和7.30 mg/g。在此基础上,进行pH分阶段控制,第一阶段（0-72 h）将pH控制在5.0,第二阶段（72-144 h）将pH控制在4.0,有利于虾青素的合成,其虾青素产量、虾青素得率和细胞产率分别为Pmax=150.11 mg/L、Yp/s=3.11 mg/g和Yp/x=7.10 mg/g,均高于对照组。采用葡萄糖混合乙醇的两阶段补料策略最有利于法夫酵母菌株的高密度培养和虾青素的大量生产,生物量、总类胡萝卜素和虾青素得到了显著的提高,分别达到35.87 g/L、393.17 mg/L和304.71mg/L,分别是分批培养的1.6倍、2.4倍和2.2倍。