SARS-CoV主要结构蛋白的基因表达及DNA疫苗构建

论文摘要

严重急性呼吸道综合症（severe acute respiratory sydrome, SARS）的病原体为SARS冠状病毒,SARS-CoV中参与病毒组装和细胞侵染过程的物质主要为4种结构蛋白（S、M、N、E）,这些蛋白是决定SARS-CoV独特的生物学行为的物质基础,正确表达这四种结构蛋白对于SARS的诊断,试剂开发和疫苗的构建有着深远的意义。 本课题研究的目的是用大肠杆菌表达的SARS冠状病毒的主要结构蛋白S、M、N、E作为抗原检测SARS-CoV抗体的可行性,及其这4个结构蛋白基因构建的DNA疫苗诱发小鼠产生抗SARS-CoV的IgG水平。研究方法:首先克隆了SARS-CoV主要结构蛋白（S、M、N、E）的编码基因,以pET-15b、pET-22b、pQE-2为载体,并分别在原核系统中表达,表达的蛋白均以可溶的形式存在,根据融合蛋白的性质采用亲和层析的方法获得纯化的重组蛋白M15b、M22b、rN、rS1、rS2、E15b。同时将这四个主要蛋白的编码基因克隆入真核表达载体pSecTagB,构建DNA疫苗,免疫小鼠后获得抗血清,并进行了一系列的ELISA检测。结果发现以重组蛋白作为抗原进行ELISA检测能与免疫了DNA疫苗的小鼠血清以及SARS病人恢复期血清均可发生特异性的抗原抗体反应;另外,用SARS全病毒作为抗原（华大公司SARS检测试剂盒）也可以和免疫鼠血清发生抗原抗体特异性反应。重组蛋白可以在大肠杆菌中得到高效表达,并可作为SARS检测的抗原。构建的DNA疫苗可以在小鼠体内产生抗SARS的特异性抗体,为SARS-CoV DNA疫苗的开发提供借鉴作用。

论文目录

• 中文摘要
• ABSTRACT
• 第一部分 前言
• 1 SARS-CoY的病毒学特征
• 2 严重急性呼吸道综合症（SARS）的检测
• 3 SARS-CoV病毒的疫苗研究
• 第二部分 实验材料与方法
• 1 实验材料
• 1.1 菌株和试剂
• 1.2 载体图谱
• 1.3 常用试剂的配制
• 2 实验方法
• 2.1 实验方案
• 2.2 重组质粒构建示意图
• 2.3 引物设计
• 2.4 重组质粒的构建和筛选
• 2.5 重组蛋白的表达与纯化
• 2.6 SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳
• 2.7 DNA疫苗的免疫
• 2.8 ELISA检测
• 3 主要仪器和设备
• 第三部分 结果与讨论
• 1 重组表达载体的构建
• 1.1 引物使用以及对应质粒的名称及融合蛋白的表达情况表
• 1.2 重组表达质粒pM15b、pM22b和核酸疫苗pSecM的构建
• 1.3 重组原核表达质粒pETS1、pETS2和真核DNA疫苗pSecS的构建
• 1.4 重组表达质粒pQEN和核酸疫苗pSecN的构建
• 1.5 重组质粒pEl5b核酸疫苗pSecE的构建
• 2.融合蛋白的表达与纯化
• 2.1 重组M蛋白的表达和纯化
• 2.2 重组S分段蛋白的表达和纯化
• 2.3 重组N蛋白的表达和纯化
• 2.4 重组E蛋白的表达和纯化
• 3 ELISA检测结果
• 3.1 重组M蛋白作为抗原的检测结果
• 3.2 重组S作为抗原的检测结果
• 3.3 重组N蛋白作为抗原的检测结果
• 3.4 重组E蛋白作为抗原的检测结果
• 4 讨论
• 4.1 质粒构建情况讨论
• 4.2 融合蛋白的表达情况分析
• 4.3 蛋白纯化中遇到的问题
• 4.4 ELISA结果分析
• 第四部分 结论
• 参考文献
• 附录1 发表的论文
• 致谢