广藿香青枯病病原菌鉴定及致病性测定

论文摘要

本文主要对广藿香青枯病菌进行分离培养,并从显微形态、生理生化特征、致病性及其16s rDNA序列分析等方面进行了研究,以期了解广藿香青枯病病原菌的组成及分化情况,为广藿香青枯病的综合防治和抗病育种奠定基础。本研究主要结果如下：1国内外研究评述查阅了与本研究相关的国内外文献,概述了广藿香的研究现状；总结了青枯菌的命名分类、基因组学、致病机理、流行学、分离鉴定与诊断技术等方面的研究现状;并介绍了植物病原菌致病性测定的几种主要方法。2广藿香青枯菌的分离培养及生化型测定以感染了青枯病的广藿香植株为材料分离青枯菌,从培养特性、形态学、生化型等多个方面进行研究,同时采集病区根际土壤样品,分析比较其pH值,探讨土壤pH值与病害流行之间的关系。结果表明：在病害流行期,病株根际土壤pH为6.46与青枯菌室内培养最适生长pH6.6较为接近,表明土壤酸碱度对青枯病发生及流行有一定的影响。分离获得的7个供试菌株(HX1～HX7)在TTC培养基上培养,呈平滑、带白色晕圈的红色菌落；菌体大小不一,大多杆状,少数为球形；根据青枯菌生化型划分标准,HX5、HX7属于生化型Ⅰ,HX1、HX6和GIM1.7(番茄青枯菌)为生化型Ⅱ,HX2、HX4划为生化型Ⅲ,HX3属于生化型V。这证明田间感染了青枯病的广藿香植株中,存在多个生理小种的青枯菌株,它们在培养特性、形态学、生化型等方面均存在一定的差异。3广藿香青枯菌致病性测定以广藿香试管苗及无根苗为材料,分别接种青枯菌菌液及粗毒素,进行致病性测定。结果表明：针刺、伤根和茎枝浸泡3种不同接种方法的试验中,从发病时间、病程发展速度及操作简易性等方面综合比较,伤根浸泡法较宜用于广藿香苗期接种致病性；除HX2外,其余菌株均能引起与田间广藿香青枯病株相似的青枯、萎垂等典型症状,且大部分菌株致病性均强于参照菌株GIMl.7,其中HX4、HX5、HX6和HX7在接种36h时,病级指数均达3.0以上；在粗毒素接种外植体的试验中,除HX1和HX2制备的粗毒素致病性较弱,病级指数均在0.7以下,其余菌株制备的粗毒素均先后表现出较强的致病力。以HX5、HX6的粗毒素致病性最强,在接种第4d平均病级指数达3.5以上,经处理的无根苗叶色黄褐,后期干枯贴于培养瓶壁。供试菌株制备的粗毒素对外植体也能引起与病原菌侵染结果相似的症状；且粗毒素的致病性与其对应的菌株致病力强弱相关；粗毒素是广藿香青枯菌致病的重要因素。致病性试验表明,不同青枯菌菌株致病力有明显的分化。4广藿香青枯菌16S rDNA序列分析以致病性较强的供试菌株为材料,采用不同的提取方法抽提青枯菌基因组DNA,利用细菌通用引物进行16S rDNA片段PCR扩增,比较不同纯度的模板DNA、退火温度、模板量对PCR扩增效果的影响。PCR产物回收测序后的16S rDNA序列在NCBI (http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi)中Blast,应用Mega4.0将相似序列进行多重序列比较后,再用邻接法构建系统发育树,结果表明：菌落直接PCR虽然经济,但效果不佳；水煮法和裂解液法操作过程简易粗放,模板量不易控制,重复性不佳；细菌基因组DNA提取效果以CTAB/NaCl和试剂盒法较为稳定；最适退火温度为55℃；HX4与欧文氏属(嗜维管束菌)E. stewarti的16S rDNA序列同源性为95%,HX7与黄单胞菌属(黄单胞杆菌)Xanthomonas的16S rDNA的序列同源性达99%,参照菌株GIM1.7与雷尔氏菌属(茄青枯假单胞杆菌)R. solanacearum 16s rDNA序列的同源性为99%。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 引言
• 1 国内外研究现状和评述
• 1.1 广藿香的研究概况
• 1.1.1 广藿香种质资源与鉴定
• 1.1.2 广藿香栽培和育种
• 1.1.3 广藿香青枯病的防治
• 1.2 青枯菌的研究现状
• 1.2.1 青枯菌的命名和分类
• 1.2.2 青枯菌的基因组学
• 1.2.3 青枯菌的致病机理
• 1.2.4 青枯菌的流行与传播
• 1.2.5 青枯菌分离鉴定与诊断技术
• 1.3 植物病原菌致病性测定的研究进展
• 1.3.1 田间鉴定
• 1.3.2 室内鉴定
• 1.3.3 植物病原细菌致病性测定的接种方法
• 2 广藿香青枯病菌的分离及生化型测定
• 2.1 材料和方法
• 2.1.1 材料
• 2.1.2 方法
• 2.2 结果与分析
• 2.2.1 青枯病症状
• 2.2.2 广藿香种植地根际土壤pH值分析
• 2.2.3 青枯菌的分离培养
• 2.2.4 青枯菌的显微特征
• 2.2.5 不同青枯菌菌株生化型测定
• 2.3 讨论
• 3 广藿香青枯病菌致病性的测定
• 3.1 材料和方法
• 3.1.1 材料
• 3.1.2 方法
• 3.2 结果与分析
• 3.2.1 青枯菌不同接种方法的比较
• 3.2.2 不同青枯菌菌株致病性差异
• 3.2.3 不同青枯菌菌株制备的粗毒素致病性差异
• 3.3 讨论
• 4 广藿香青枯病菌16S rDNA序列分析
• 4.1 材料和方法
• 4.1.1 材料
• 4.1.2 方法
• 4.2 结果与分析
• 4.2.1 不同提取方法对细菌DNA纯度的影响
• 4.2.2 供试菌株16S rDNA片段PCR检测
• 4.2.3 供试菌株16S rDNA分析
• 4.3 讨论
• 5 结论与展望
• 5.1 结论
• 5.2 展望
• 参考文献
• 图版
• 图版Ⅰ 广藿香青枯病症状
• 图版Ⅱ TTC培养基上的供试菌株与番茄青枯菌
• 图版Ⅲ 广藿香青枯菌菌体形态
• 图版Ⅳ 广藿香青枯菌菌株致病性
• 附录
• 附录Ⅰ HX4、HX7及GIM1.7菌株序列比对结果
• 附录Ⅱ 英文缩略词表
• 附录Ⅲ 已发表论文及获奖情况
• 致谢