吡格列酮对胰岛素抵抗大鼠认知功能及脑组织AGEs-RAGE信号传导途径的影响

论文摘要

研究背景胰岛素抵抗（insulin resistance,IR）是糖尿病重要的发病机制之一,贯穿于糖尿病的发生、发展全过程,同时也是导致糖尿病并发症的根源。流行病学研究显示:胰岛素抵抗综合征患者心血管疾病和脑卒中的风险增加3倍,病死率明显增高。研究结果显示,胰岛素抵抗是认知功能下降的重要危险因素。认知功能损害早期主要表现为学习和记忆功能的下降。中枢胆碱能系统在学习和记忆行为中有重要的调节作用,保持其功能正常,是维持哺乳动物学习记忆的必要条件。胰岛素抵抗以高胰岛素血症、糖脂代谢紊乱等为主要特征。而长期高血糖能引起机体内多种物质发生糖基化反应,产生糖基化终末产物（advanced glycation endproducts,AGEs）。近来的研究显示:糖基化终末产物-糖基化终末产物受体（receptor for advanced glycation end product,RAGE）通路激活是糖尿病靶器官损害的重要机制之一,该通路活性增强与衰老、认知障碍及外周神经病变有密切的关系。吡格列酮属于噻唑烷二酮类药物,是一种新型的胰岛素增敏剂,通过增加组织对胰岛素的敏感性改善胰岛素抵抗,降低血糖水平,其生物学效应主要是通过激活过氧化物酶体增殖物活化受体γ（Peroxisome Proliferator-activatedreceptor gammar,PPARγ）实现的。有研究报道PPARγ激活剂能够减少缺血再灌注脑梗塞体积,具有脑保护作用。目前国内未见对胰岛素抵抗时认知功能下降机制以及PPARγ激活剂对中枢AGEs-RAGE信号通路影响的研究报道。目的（1）探讨高果糖诱发的胰岛素抵抗大鼠认知功能、胆碱乙酰转移酶（cholineacetyltransferase,ChAT）活性及胰岛素样生长因子-1（insulin-like growth factor-1,IGF-1）的变化（2）探讨高果糖诱发的胰岛素抵抗大鼠脑组织AGEs-RAGE损伤途径的变化。（3）探讨吡格列酮（Pioglitazone,PIO）在胰岛素抵抗大鼠脑损伤中的作用及机制方法45只6～8周龄清洁级健康雄性Wistar大鼠（购于山东大学实验动物中心）,体重180～200g,适应性喂养1周,从中随机选取10只作为正常组（NC组）,标准啮齿类动物饲料喂养,饮用自来水;其余35只标准啮齿类动物饲料喂养,饮用10%的果糖水,（参考Reaven GM）制作胰岛素抵抗模型。4周后根据胰岛素抵抗指数（insulin resistance index,IRI）将制作成功的胰岛素抵抗模型动物随机分为胰岛素抵抗组（IR组）和吡格列酮组（PIO组）。吡格列酮干预方法:在检测模型成功后,IR组及PIO组继续标准啮齿类动物饲料喂养,饮用10%的果糖水至实验结束,PIO组同时按10 mg/（kg·d）灌胃给药,NC组与IR组灌服相应体积的生理盐水,共计12周。干预12周后,进行以下测试:1.测定各组大鼠体重、血糖、胰岛素水平,计算胰岛素抵抗指数;2.通过Morris水迷宫实验观察大鼠认知功能改变情况;3.比色法测定脑组织中ChAT活性;4.免疫荧光检测脑组织AGEs的表达;5.Western blot脑组织中PPARγ、RAGE、磷酸化核转录因子-κB（Phospho-NF-κB p65,Ser536）、IGF-1表达。6.对脑组织切片进行尼氏染色,以观测各组大鼠脑组织形态学及尼氏体改变结果1各组大鼠体重、空腹血糖、胰岛素水平的比较干预第12周末IR组、PIO组大鼠体重、空腹血糖较NC组有增高趋势,但差异无统计学意义（P＞0.05）;IR组胰岛素水平较NC组明显增高（P＜0.01）,PIO组胰岛素水平较NC组增高（P＜0.05）;PIO组胰岛素水平明显低于IR组（P＜0.01）。2 Morris水迷宫实验成绩比较IR组逃避潜伏期较NC组明显延长（P＜0.01）,PIO组逃避潜伏期较NC组延长（P＜0.05）,PIO组逃避潜伏期较IR组明显缩短（P＜0.01）3.胆碱乙酰转移酶活性比较与NC组（69.042±7.6603）比较IR组（36.9225±5.0859）ChAT活性降低,差异有显著性（P＜0.01）。与IR组比较PIO组（50.0825±6.2224）ChAT活性增强,差异有显著性（P＜0.05）,但仍低于NC组（P＜0.01）。4.免疫荧光法检测AGEs的表达NC组大鼠海马、皮层细胞排列密集,可见AGEs在细胞浆表达,表达较弱;IR组细胞排列疏松,AGEs表达呈强阳性;与IR组相比较,PIO组细胞排列较紧密;AGEs表达强度减弱,阳性细胞数减少。5.Western blotting检测脑组织PPARγ、RAGE、Phospho-NF-κB、IGF-1表达①IR组和PIO组RAGE的蛋白表达水平较NC组升高,分别为NC组的1.68倍、1.24倍;与IR组相比,PIO组RAGE的蛋白表达水平下降26.2%,差异有统计学意义（P＜0.01）。②IR组和PIO组磷酸化NF-κB的蛋白表达水平较NC组升高,分别为NC组的1.58倍、1.27倍;与IR组相比,PIO组磷酸化NF-κB的蛋白表达水平下降19.6%,差异有统计学意义（P＜0.01）。③IR组和PIO组PPARγ的蛋白表达水平较NC组降低,分别为NC组的0.72%、0.89%;与IR组相比,PIO组的PPARγ蛋白表达水平升高,为IR组的1.23倍,差异有统计学意义（P＜0.05）。④IR组和PIO组IGF-1的蛋白表达水平较正常对照组降低,分别为NC组的35.7%和48.05%;与IR组相比,PIO组的IGF-1蛋白表达水平升高,是IR组的1.35倍,差异有统计学意义（P＜0.05）6.组织形态学改变尼氏染色:NC组各脑区神经元形态正常,胞核膜和核仁清晰;IR组小鼠的额叶皮质、海马的细胞排列稀疏,细胞间隙增大,细胞胞浆内Nissl体减少或消失。PIO组比IR组有所改善,神经元细胞排列尚整齐、密集,胞浆中Nissl体较丰富。结论1.胰岛素抵抗大鼠神经细胞发生病理性损害,认知功能下降,可能与脑组织IGF-1表达下降,ChAT活性降低,神经元凋亡增加,乙酰胆碱（Acetylcholine,ACh）释放减少有关。2.胰岛素抵抗大鼠脑皮质、海马区的AGEs、RAGE、磷酸化NF-κB蛋白表达增加;PPARγ表达降低。提示AGEs-RAGE及下游通路的激活可能参与脑组织损伤过程。AGEs-RAGE通路活性增强与PPARγ活性降低有关。3.吡格列酮通过促进PPARγ表达增加,增强中枢ChAT活性,增加IGF-1表达,维持胆碱能神经功能,对模型大鼠的学习记忆功能减退具有改善作用。同时吡格列酮通过PPARγ对AGEs-RAGE通路产生抑制作用,继而改善胰岛素抵抗大鼠的认知功能。意义本课题通过运用Western blot、免疫荧光、尼氏染色、比色法等方法,观察了吡格列酮干预前后胰岛素抵抗大鼠脑组织中AGEs、RAGE、NF-κB、PPARγ、ChAT、IGF-1表达的变化以及大鼠逃避潜伏期的变化,探讨了IGF-1、ChAT在胰岛素抵抗大鼠脑组织中的变化,AGEs-RAGE通路在胰岛素抵抗脑损伤机制中的作用,以及吡格列酮对胰岛素抵抗大鼠脑组织损伤的作用和对AGEs-RAGE通路的影响,为临床胰岛素抵抗中枢神经损伤的防治提供理论依据。

论文目录

• 中文摘要
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• 符号说明
• 前言
• 材料与方法
• 结果
• 讨论
• 结论
• 附表
• 附图
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• 学位论文评阅及答辩情况表