论文摘要
现代某些遗传学研究领域，如法医学分析，出生前或植入前诊断（preimplantation genetic diagnosis，PGD），或致瘤因子检测中，DNA分析通常只是针对小量细胞甚至单个细胞。有限的基因组DNA（genomic DNA，gDNA）即通常所说的低拷贝数（low copy number，LCN）DNA常常限制这些检测的敏感性。另一方面，临床实践和法医学实践中由于种种外界条件的限制，长期以来在生物样本中，获得理想的高质量的DNA一直是个难题。DNA常受光、热、湿度、温度、微生物等多种因素的影响而发生降解。因此，DNA的质和量是影响DNA分析的两个重要因素。福尔马林固定、石蜡包埋组织（formalin fixed and parafiin embedded，FFPE）是现在运用最广的用于回顾性研究的材料。一般认为，从福尔马林固定的组织样本中分离出的DNA常成高度降解状态，平均片段大小在60-200bp之间。DNA的降解可发生于组织准备、福尔马林固定和石蜡包埋的不同阶段，这对于DNA检测的敏感性会产生不利影响。通常大于300bp的扩增片段较难在石蜡包埋组织进行基因表达研究。扩增片段越短，结果越可靠。但是，当扩增片段太小时，常较难针对限制区域设计引物，并且容易使一些与疾病相关的重要基因的改变被漏检。那么，如何提高这些质和量较差样本检测的敏感性是研究者面对的一个难题。聚合酶链反应（Polymerase chain reaction，PCR）技术的发展和应用使得微量甚至单个细胞DNA的分析成为可能，极大促进了法医学、分子针断学和分子病理学的发展。但即使对于非常敏感的PCR技术，许多材料所能提供的DNA量也不足以被成功检测。为能从少量细胞中最大限度的获取信息，全基因组扩增（Wholegenome amplification，WGA）技术应运而生。简并寡核苷酸引物（degenerateoligonueleotide primed Polymerase chain reaction，DOP-PCR）是一种全基因组DNA扩增技术，因其扩增DNA具有均匀性，故该技术已开始应用于微量组织的全基因组DNA分析。DOP-PCR引物是由其3’和5’端的特异核苷酸序列和中间的6个核苷酸构成的随机引物组成。其PCR程序是先在低退火温度下进行几十个循环的低严谨扩增，然后下一轮的严谨扩增中又将低严谨的产物再次放大，从而使整个基因组得到放大。此外，样本DNA的纯化方式也是影响基因分析的一个重要因素。我们现在常用的纯化方式包括酚氯仿抽提法、chelex抽提法、硅粒纯化法等，这些方法都因为抽提过程中不能获得较高质量的DNA或者产生PCR抑制物而使其应用受到限制。DNA IQTM System试剂盒是一种较新的能够针对小样本获得较高质量DNA的纯化方法。该方法采用一种包裹有磁性粒子的树脂分离DNA，该磁珠具有与DNA较强的特异结合能力，能够较强的吸附DNA而较完全的保留DNA。样品中的DNA首先通过裂解液的作用释放出来，然后在有结合液存在的情况下特异性地与磁珠微粒子结合，结合了DNA的磁珠被磁场俘获，通过洗涤将污染物除去，然后利用洗脱液将DNA洗脱下来，从而获得高质量的DNA.。该方法主要是用于小量DNA的快速纯化并且能获得一致的产量。线粒体DNA（mtDNA）由于其高拷贝数现已较多运用于质量较低的样本中。线粒体DNA是细胞内相对独立的基因组，基因组结构比较简单，并具有很高的专一性，独特性。它的传递、重组、分离、复制、转录都可应用分子生物学的许多手段和方法进行分析。因此，线粒体DNA不仅是研究DNA结构与DNA复制、转录的良好模型，也是研究真核细胞核酸与蛋白质合成等一般问题非常合适的模型系统。通常一个细胞内有多个mtDNA拷贝（核DNA拷贝数的10倍左右），因此对于一些核DNA降解较为严重的样本，检测mtDNA更容易得到有意义的结果。为此，我们首先利用细胞系建立参考DNA标准，选择目前公认的常染色体和性染色体上的STR，及β2微球蛋白以及线粒体DNA三类DNA片段标签序列，利用常规蛋白酶K-酚氯仿抽提法、DOP-PCR、DNA IQTM System、以及联合应用DNA IQTM System和DOP-PCR确定能抽提出的细胞最小数，以此为标准，检测福尔马林固定、石蜡包埋组织中DNA的质量。材料与方法1材料（1）培养细胞系：选择人胚胎羊膜成纤维细胞FL及人结肠癌细胞系RKO，MEM和RPMI 1640（均含10％超级新生牛血清）为培养基，，放入37℃，5％CO2～95％空气饱和湿度培养箱中孵育。待细胞生长接近融合，采用0.25％胰酶消化法，按1∶2～3比例进行传代培养。细胞计数板计数后，采用稀释法获得一定数目细胞，离心收集后待用。（2）福尔马林固定、石蜡包埋组织：选取1997-2005年我医学院附属医院及省内其他医院的标本，全部经中性福尔马林固定、常规石蜡包埋。2方法（1）经典蛋白酶K-酚氯仿法抽提细胞DNA，测定DNA浓度，依次通过1∶5、1∶10、1∶20、1∶30、1∶40、1∶50稀释，确定能扩增出的最小DNA量。（2）选择扩增常染色体、常染色体STR和性染色体STR、线粒体DNA基因片段。分别为β2微球蛋白，Cyclin D1，D2S1338，D13S317，DXS6803，DXS7130，DYS19，DYS391，D2，D4，HⅥ，HⅦ。（3）分别采用蛋白酶K-酚氯仿法、DNA IQTM System、DOP-PCR法、以及联合应用DNA IQTM System和DOP-PCR法抽提扩增不同数目细胞，产物经1.5％琼脂糖电泳后判断不同方法能检测出DNA的最少细胞数。对于STR扩增产物经变性后行8％聚丙烯酰胺凝胶电泳分析。（4）针对福尔马林固定组织，蛋白酶K消化后，分别采用酚氯仿法、DNA IQTMSystem、DOP-PCR法、以及联合应用DNA IQTM System和DOP-PCR法纯化检测DNA。产物检测方法同（3）。结果1．经酚氯仿抽提后，依次稀释DNA后，使用β2微球蛋白引物可扩增出的DNA量最低为40ng。2．单纯采用蛋白酶—酚氯仿抽提法，可扩增出DNA的最低细胞数约为2500个，约为300ng。3．采用DOP-PCR法，可扩增出DNA的最低细胞数为300个，约36ng。扩增引物分别为β2微球蛋白，D2，D4。4．采用DNA IQTM System，扩增β2微球蛋白片段，其敏感性增加到125个细胞，而应用线粒体引物D2，D4，其敏感性可达60个细胞，约为7.2ng。但DXS7130和D2S1338片段扩增的敏感性仅分别为250和1000。5．联合应用DNA IQTM System和DOP-PCR，可将DXS7130片段的扩增敏感性提高到75个细胞。6．在FFPE样本中，使用β2微球蛋白引物可扩增出的DNA量最低为100ng。利用DNA IQTM System检测敏感性约为800ng，利用联合应用DNA IQTM System和DOP-PCR可将5ng扩增到1.25μg，扩增倍数为250倍。结论1．在我们的实验条件下，使用DNA IQTM System检测DNA的敏感性优于DOP-PCR。2．联合应用DNA IQTMSystem和DOP-PCR，可将DNA扩增敏感性提高到2倍以上。3．线粒体DNA检测可用于降解较严重的DNA样本。4．病理样本中的DNA质量除了受样本制作时不同程度DNA降解影响外，更重要的可能是外界各种因素“遮盖”DNA而导致体外扩增失败。
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标签：全基因组扩增论文; 低拷贝论文; 简并寡核苷酸引物论文; 线粒体论文; 福尔马林固定石蜡包埋组织论文;